The Effects of Cations on the Stability of Triple Helix Nucleic Acid
WU Ruiguang, YU Zhiwu, ZHOU Rui
(Bioorganic Phosphorus Chemistry Laboratory,
Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084)
Abstract The effect of cations on the
stability of triple helix DNA is of importance in the understanding of its
structure-function relationship. Both experimental methods and latest findings concerning
the stability of triple helix DNA are summarized . In the context of discussions of
remaining problems, suggestions for further investigations are also made.
Key words Triple helix DNA, Stability, Thermal stability, Cation effect
摘要 三链DNA的稳定性是其研究领域的热点之一，而阳离子效应又是影响这一稳定性的重要因素。本文总结了近年来这方面工作的实验方法和结论，并讨论了目前还存在的需进一步研究的问题。
关键词 三链DNA 稳定性 热稳定性 阳离子
三链核酸稳定性的阳离子效应研究进展
邬瑞光 尉志武** 周蕊(清华大学化学系生命有机磷化学教育部重点实验室 北京 100084) 自从1953年Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型以后，在相当长的时间内Watson-Crick双螺旋结构模型一直被认为是DNA分子的唯一的结构模型。人们普遍认为DNA结构与聚核苷酸的组成和序列无关。但是，随着现代物理技术(特别是X射线单晶衍射分析)的发展及其在核酸结构研究方面的广泛应用，以及对涉及到DNA(或RNA)的生命过程的不断深入了解，人们逐渐发现生物体中DNA的存在具有多样性，除标准的双螺旋DNA(B-DNA)外，依赖于核苷酸组成及序列、DNA分子的整体拓扑学性质和外界环境条件，DNA分子还可以采取不同的构型，这包括DNA双螺旋的不同变异结构及多链结构(包括三螺旋和四螺旋DNA)。特别是DNA的三螺旋结构，由于它的强大的生物学功能因而在生物工程和医药领域中得到了广泛的重视。
三链核酸是50年代首次被提出，80年代得到广泛研究的核酸家族的一名新成员。近年来，随着核磁共振等实验技术的发展，科学家们逐渐掌握了越来越丰富的关于三链DNA结构特征和构象方面的信息[1]。在此基础上，人们设计出了许多基于DNA三螺旋的可能的实际应用，如对双链DNA的识别与切割，基因药物，反基因战略，基因重组等技术。其中最为人们关注的是三链DNA结构在生物体内的存在意义和可能的生物学功能。如第三条寡聚核苷酸链(简称ODN，下同)可以通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，增强或抑制基因的表达；通过形成三链可以防止双链DNA被酶切，对双链DNA中的靶序列起到保护作用；同样也可把ODN作为切割靶序列的分子剪刀，其作用机理是在ODN的末端连上一个化学试剂，通过氧化损伤或辐射损伤使双链断裂，从而起到切割的目的。但要想实现这些构想并不容易，遇到的一个主要障碍即是形成的三螺旋DNA的稳定性不够好。因此，研究DNA三螺旋的稳定性具有重要的意义。
与双螺旋结构不同的是，三螺旋DNA不是DNA在自然态下的主要结构，而是在特定的条件下形成的。它是由一条ODN通过与双链DNA形成Hoogsteen键或反Hoogsteen键，在其大沟处紧密缠绕而成。具体就是富含嘧啶的ODN与双链DNA的富含嘌呤的链以平行的方式键合，形成Hoogsteen键；富含嘌呤的ODN与双链DNA的富含嘌呤的链以反平行的方式键合，形成反Hoogsteen键。与双螺旋相类似，三螺旋DNA的组成结构基元是三碱基体。目前一般认为三碱基体有嘧啶-嘌呤-嘧啶型(Py-型)和嘌呤-嘌呤-嘧啶型(Pu—型)两种基本类型。这些三碱基体也具有专一性，具体体现在T、C+、G、A分别要接在AT、GC、GC和AT碱基对上。三碱基体的这四种主要类型如图1所示。
Hoogsteen键或反Hoogsteen键的形成只是构筑三螺旋的必要条件；要想使三螺旋具备一定的生物学功能，实现它的实际应用，还必须保证它具有一定的稳定性，这正是本文所关注的。影响三螺旋DNA稳定性的因素可分为内部因素和外部因素两方面。内部因素主要是指链长、碱基序列组成、骨架本性等因素。这些因素主要是通过影响第三条链键合时碱基配合的强度、氢键相互作用的强度以及双链受体重排时的能量大小来影响所形成的三螺旋的稳定性的。许多研究表明，碱基错配对三螺旋稳定性的影响很大，这对于理解三螺旋结构在体内形成的专一性具有明显重要的意义。另外，不同位置的错误匹配对稳定性的影响也不同。比如，中心部位的错误匹配就要比靠近两端的错误匹配使螺旋更加不稳定[2]。影响三链核酸稳定性的外界因素主要包括溶液的pH值、溶液中阳离子的浓度、配基结合作用力的大小等。需要指出的是，尽管已发现在生物体内和体外都可以形成三螺旋DNA结构，但研究各种外界因素特别是金属离子对三螺旋DNA稳定性的影响时大多是从化学的角度、在生物体外进行的；但在生物体外的研究对于指导三螺旋结构在生物体内的应用同样具有很重要的意义。关于内外各种因素对三螺旋DNA稳定性的影响情况虽然孙雪光等已作了较为详细的的综述[3]，但对阳离子效应的阐述不够具体；由于阳离子效应的重要性，更由于最近几年新的研究成果的出现，本文将对它进行较为详细的总结。
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| 图1 三碱基体的主要类型 |
由于每个核苷酸的磷酸基团都带有一个负电荷，因此每条DNA单链都带有高线性密度的负电荷,链与链之间存在着很大的排斥作用。这样，就需要阳离子或带正电荷的分子(如精胺)来抗衡磷酸骨架之间的相互排斥作用。其中Py-型三螺旋仅需要电荷与离子半径之比较低的阳离子(如Na+)，而Pu-型三螺旋则需要电荷与离子半径之比较高的阳离子(如Mg2+,Ca2+)。对含有双核苷酸重复序列的异源三螺旋而言，较小的阳离子(如Zn2+)是必需的[4]。除了钠、镁等金属离子外，还有一些重要的多价阳离子如三价的钴铵络离子以及四价的精胺离子等，它们对于某些三链结构形成的重要性是其它离子不可替代的。如有人发现在溶液中没有这两种离子的情况下，即使镁离子的浓度高达10 mmol/L或钾离子的浓度高达500 mmol/L，也看不到一个包括15个三碱基体的三链核酸结构的形成[5]。总之，三螺旋的形成广泛依赖于阳离子的存在。 2 研究方法
研究各种价态的离子对DNA三螺旋稳定性的影响是三链核酸热力学研究领域中的一个热点。人们一方面关心等温下DNA三螺旋的化学稳定性，即三螺旋形成反应的平衡常数；另一方面，人们也关心三螺旋DNA的热稳定性，即温度的变化对三螺旋稳定性的影响，体现为解螺旋温度的高低。在研究方法上，涉及到的主要有量热法、定量亲合裂解滴定法、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(Dnase Ⅰ)足迹法、荧光光谱法等，下面分别介绍。
2.1 量热法
量热法是通过测量三链核酸形成时或裂解时(变为单链和双螺旋)的热效应从而求得体系的热力学参数值。文献报道的主要有差示扫描量热法(DSC)和等温滴定量热法(ITC)。差示扫描量热法是对已经形成的三螺旋DNA体系进行差热分析，通过对三螺旋裂解的吸热峰进行分析，得出三螺旋DNA裂解反应的热力学数据。Plum等用这种方法研究了含15个三碱基体的Py-型三螺旋DNA体系的热力学性质，发现三螺旋DNA的热稳定性随着钠离子浓度的增大而增大，并且测得在pH=6.5时三碱基体的裂解焓约为8.4 kJ/mol[6]。等温滴定量热法是在等温下通过滴定直接测定ODN与双链DNA形成三螺旋结构过程中的热力学参数。Kamiya等用这种方法研究了在含NaCl，MgCl2等盐的缓冲溶液中(pH=4.8)，含15个三碱基体的Py-型三螺旋DNA的形成反应，测得三碱基体的形成焓约为22.2 kJ/mol[7]。
2.2 定量亲合裂解滴定法
由于量热法是依据热力学基本关系式，通过一系列计算求得三链核酸的形成平衡常数，这样就会使数据的准确性降低。为了减小误差，人们发展了一种基于凝胶电泳的直接测平衡常数的实验方法，一般称作定量亲合裂解滴定法。这种方法的基本原理在于三螺旋与单链及双螺旋的电泳运动性质有显著差别，故可用凝胶电泳法使反应混合物分离，然后定量。定量的基本方法及原理是：开始时，使一种未被激活的DNA切割剂(EDTA·Fe)与ODN共价结合，这样做不影响后者与双螺旋的结合。在其与双螺旋作用形成三螺旋后再加入一种切割激活剂--二硫苏糖醇，它可以启动DNA切割剂对双链中被键合部位附近一带Watson-Crick碱基对的切割。然后切割和未切割的双链DNA在凝胶上被电泳分离，并且被定量。由于切割片断是与双链中被结合的片断(需被标记)直接相关的，故通过切割片断的浓度与ODN浓度的关系曲线可求得三螺旋的结合平衡常数[5,8]。
Singleton等[9]用这种方法研究了在不同浓度的KCl，MgCl2以及SpmCl4(四氯化精胺)等盐存在的情况下(pH=7.0,22°C)，含15个三碱基体的三螺旋DNA的形成常数。他们发现在含10 mmol/L NaCl、1.0 mmol/L MgCl2、1.0 mmol/L SpmCl4的溶液中，加入KCl溶液，浓度从5.0 mmol/L到140 mmol/L，三螺旋的形成平衡常数将降低100倍。而在含10 mmol/L NaCl, 140 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2的溶液中，加入SpmCl4溶液，浓度从0.40 mmol/L到4.0 mmol/L，将使三螺旋DNA形成平衡常数增大500倍。这些实验现象符合由阳离子价态决定的离子对三螺旋稳定性的影响规律：Spm4+>Mg2+>K+(按稳定性由大到小的顺序)。说明阳离子价态越高，越有利于三螺旋的形成。
2.3 脱氧核糖核酸酶Ⅰ(Dnase Ⅰ)足迹法
足迹法是分析DNA上蛋白质结合位点的常用方法。这种方法把凝胶电泳、印迹技术和放射性标记技术融为一体，其基本原理类似于DNA序列测定的方法。这种技术近年来也被用来研究三链核酸的形成及其化学稳定性。具体方法就是：把双链DNA的一端用放射性P(Y32P)标记，然后与ODN混合，充分反应后形成三螺旋结构，然后用Dnase Ⅰ水解(切割)。产生的水解片断(被标记)很容易从聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中确定。原则上每个磷酸二酯键都可随机地被水解，产生各种长度的片断；但是由于ODN阻止了Dnase Ⅰ的切割作用，因此最后的产物在PAGE中自显影时就会出现一段空隙，代表由于形成三螺旋结构而没有产生的水解片断。
Floris等[10]用这种方法研究了混合价态离子的溶液中Pu-型三螺旋DNA的稳定性随离子浓度的变化情况，发现在含10mmol/L MgCl2的溶液中，加入NaCl溶液，浓度从20mmol/L到140mmol/L,将明显地降低三螺旋DNA的稳定性。另外，他们还发现了一个重要的现象：在保持一价离子总浓度不变的情况下，逐渐增大K+的浓度(同时降低Na+的浓度)，将使三螺旋DNA更加不稳定。但若用Li+代替K+，则看不到这一现象。此外，他们还发现在溶液中存在少量二价过渡金属离子(如Mn2+,Ni2+)的情况下，也看不到K+的上述使三螺旋不稳定的现象。这可能是由于二价过渡金属离子与鸟嘌呤碱基G的7位N原子发生作用，使G·GC三碱基体之间的氢键增强，从而减少了形成G*G*G*G四联体的机会。
Blum等用这种方法研究了在不同的阳离子的作用下，富含鸟嘌呤G的ODN与双链DNA形成三链结构以及ODN自身内部形成四螺旋结构这两个平衡之间的竞争情况。发现K+对四螺旋的稳定作用被低浓度的Mn2+(4～10mmol/L)或Co2+(0.3～2mmol/L)或Ni2+(0.3～0.8mmol/L)所削弱。他们还发现Mg2+对三螺旋结构有很大的稳定作用，但却被K＋所削弱[11]。
2.4 荧光光谱法
Yang等发展了两种基于荧光光谱的实验方法用来研究三链核酸结构的形成过程及其热力学和动力学参数：荧光共振能转移法(FRET法)和荧光各向异性法。前者的基本原理是把荧光给体和荧光受体分别标记在双链DNA和ODN的5’端，并在形成三螺旋的过程中对双链DNA进行激发；由于荧光给体和受体之间偶极子相互耦合的结果使发射的荧光能量非辐射地转移到荧光受体中。通过测量在整个反应过程中荧光强度的变化，最后可求得三螺旋DNA的形成平衡常数。后者的基本原理是荧光各向异性值(荧光偏振)可反映荧光分子对时间平均的旋转运动；当荧光标记的ODN与未标记的双螺旋DNA形成三链结构后，整个混合物的荧光各向异性值将增大。因此只需预先对ODN进行荧光标记，通过测量反应过程中各向异性值的变化，最后可求得三螺旋DNA的形成平衡常数。这两种方法比上述其它方法的一个很明显的优点是时间分辨率高；它们不仅能跟踪螺旋形成过程，而且能够很灵敏地跟踪解螺旋过程；既可以用来研究热力学性质，也可以用来研究动力学方面的性质(如反应速率等)。Yang等用这两种方法研究了三种Py-型三螺旋DNA的形成过程和热稳定性，实验结果与用其它方法得到的结果能够很好地吻合[12]。
Ellouze等用荧光各向异性值法研究了五种二价金属离子对T·AT型三螺旋DNA形成速率和裂解速率的影响,发现了一些重要的实验现象。首先是在溶液中只有一种离子的情况下，离子浓度越高，三螺旋形成速率越大。其次是对于相同浓度的二价金属离子，使三螺旋DNA形成速率由大到小的顺序为Mn2+>Mg2+>Ni2+＝Ca2+>Ba2+。另外，他们还发现三链核酸解螺旋的速率几乎不受离子浓度的影响。更重要的是，他们发现三螺旋的形成速率越大，形成的三螺旋的热稳定性也越高(解螺旋温度越高)；而解螺旋速率的大小对三螺旋的热稳定性则无明显的影响[13]。
以上是对研究影响三链核酸稳定性的阳离子效应的常用实验方法的总结。需要指出的是，人们在使用这些方法的时候，一般都要与光谱分析(如UV，CD等)相结合，以相互验证。 3 主要研究结论
大量实验表明，离子对三螺旋稳定性的影响不仅与离子本性、离子浓度有关，还与三螺旋体系本身有关(如碱基序列、组成等)。总的说来，离子对Py-型三螺旋体系的影响规律性较强，而对Pu—型三螺旋体系的影响情况就比较复杂；当溶液中只存在同一价态的离子时，离子对三螺旋稳定性的影响规律性较强；而当溶液中存在多种不同价态的离子时，离子对三螺旋稳定性的影响情况就比较复杂。因此，在考虑某一溶液环境对三螺旋DNA稳定性的影响情况时，要结合三螺旋体系本身的性质。
总结近年来的文献报道，可以得到以下一些结论：
3.1 一般规律
(1)离子对三螺旋DNA热稳定性的影响是其对三螺旋DNA形成速率影响的体现。因此，三链核酸的热稳定性主要取决于三螺旋形成时的溶液环境，而不是解链时的溶液环境[13]。
(2)对于单一种离子，形成三螺旋时离子浓度越大，形成的三螺旋化学稳定性越高。
(3)对于不同价态的离子，一般说来，价态越高，对三螺旋的稳定作用也越大。因此，当溶液中存在多种不同价态的离子时，三螺旋的稳定性体现为不同价态离子之间相互竞争的结果。如在Mg2+浓度固定不变的情况下，不断增大Na+的浓度，由于离子竞争的结果，将使三螺旋DNA的化学稳定性越来越低[9]。
3.2 对于T·A·T型三螺旋DNA
同样浓度的二价金属离子使三螺旋的热稳定性由大到小的顺序为：Mn2+>Mg2+> Ni2+＝Ca2+>Ba2+。这可能是由于它们各自与碱基的作用情况不同而造成的[13]。
3.3 对于ODN富含鸟嘌呤G的Pu-型三螺旋DNA
几种一价离子使三螺旋化学稳定性由大到小的顺序为：Na+=Li+>K+。当溶液中含多种离子时(Na+，K+，Mg2+等)，存在以下两个平衡：
| ODN(富含G) ＋ 双链DNA ——→ 三螺旋DNA | (1) | |
| ODN(富含G) ——→ G*G*G*G型四螺旋 | (2) |
实验发现，K+有利于平衡(2)而不利于平衡(1)；Mg2+有利于平衡(1)而不利于平衡(2)。而在少量过渡金属离子如锰离子、钴离子或镍离子的存在下，K+对平衡(2)的促进作用被抑制[11]。如图2所示。
4 结束语
离子对DNA三螺旋稳定性的影响是一个特别复杂的研究领域，目前尽管已经取得了一些阶段性的成果，但还有许多问题有待进一步研究。其一，关于阳离子对三螺旋热稳定性影响的研究还很不够。例如Duguid等[14]研究发现，同样是二价的金属阳离子，Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+和Mn2+使双螺旋DNA的变性温度提高，但Co2+、Ni2+、Cd2+却使双螺旋DNA的变性温度降低。因为它们各自与DNA分子的磷酸基团和碱基的作用情况不同：Raman光谱研究表明，Mg2+、Ca2+
等金属离子不直接与碱基作用，而Co2+、Ni2+、Cd2+等却与嘌呤碱基的7位氮原子及嘧啶碱基的3位氮原子有强烈的作用[15,16]。但这种不同的作用情况对DNA三螺旋的变性温度(热稳定性)的影响情况却未见报道。其二，三链核酸解链时量热焓与Van't
Hoff焓(由范特霍夫方程求得的焓值)之间存在较大差别的原因尽管有多种解释，但都不能令人满意，二者之间差别较大的原因至今仍不清楚[5]。再有，文献报道阳离子对蛋白质的变性作用可以从Hofmeister效应的角度进行解释[17,
18]，那么在阳离子对三螺旋稳定性的影响机理中是否也存在Hofmeister效应(即通过影响水的结构而影响三螺旋的稳定性)需进行深入探讨。
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| 图2 阳离子对Pu-型三螺旋稳定性的作用规律 |
深入和系统地研究阳离子对DNA三螺旋稳定性的影响规律不但有助于了解三链核酸结构的生理作用本质，而且对实现三螺旋DNA技术在生物工程中的应用具有重要意义。
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邬瑞光 男，25岁，硕士生，现从事生物物理化学的研究。**联系人
国家自然科学基金及回国人员基金资助项目。 2000-11-21收稿，2001-01-09修回。