Chemical Modification of Protein Side Chains JIANG Zhongyi, GAO Rong, XU Songwei, WANG Yanqiang (School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072) Abstract The new physicochemical and biological properties of proteins will be endowed by the appropriate chemical modification of protein side chains. In this review, a brief introduction of the current status in the chemical modification of proteins will be presented, including the basic principles, methods and approaches of chemical modification, as well as biomedical and biotechnological applications of modified protein. Key words Protein side chain, Chemical modification, Polyethylene glycol(PEG), Biomedicine, Biotechnology 摘要 通过对蛋白质侧链基团进行适当的化学修饰，可以赋予蛋白质以新的物理化学和生物学性能。本文将简要介绍蛋白质化学修饰的国内外研究进展，主要包括化学修饰的基本原理、化学修饰方法与途径、修饰蛋白在生物医学和生物技术等领域的应用。 关键词 蛋白质侧链基团 化学修饰 聚乙二醇 生物医学 生物技术 蛋白质侧链基团的化学修饰 姜忠义 高蓉 许松伟 王艳强 (天津大学化工学院 天津 300072) 作为生命活动物质基础的蛋白质的生物学活性不仅取决于其特定的一级结构(化学结构)，而且还取决于其特定的空间结构。从广义上说，凡通过活性基团的引入或除去，而使蛋白质一级结构发生改变的过程，统称为蛋白质的化学修饰。蛋白质的化学修饰[1]主要包括两个方面：(1)蛋白质分子的侧链基团的改变；(2)蛋白质分子中主链结构的改变，属于基因重组和定点突变的方法。 蛋白质侧链基团的化学修饰(以下简称化学修饰)是通过选择性试剂(下称修饰剂)或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团(下称功能基)发生化学反应而实现的。化学修饰在蛋白质特别是酶的结构与功能研究中，曾经起到过十分重要的作用。近年来，由于化学修饰剂专一性的提高，化学修饰过程分析技术和计算方法的完善以及结构生物学的发展，化学修饰的应用领域不断得到拓宽。迄今为止，化学修饰在以下方面得到了不同程度的应用：酶和蛋白质的各级结构以及作用机理；蛋白质纯度分析与鉴定；蛋白质和酶分子的固定化；蛋白质分子的改性。 本文将简要介绍蛋白质侧链基团化学修饰的国内外研究进展，主要包括化学修饰的基本原理、化学修饰的方法、修饰蛋白在生物医学和生物技术等领域的应用等。由于篇幅所限，荧光标记、放射性标记、亲和标记等修饰技术本文没有涉及。 1 化学修饰过程 1.1 化学修饰原理 影响蛋白质化学修饰反应的主要因素有两方面：一是蛋白质功能基的反应活性；二是修饰剂的反应活性[2]。影响蛋白质功能基反应活性的因素可以归纳为两个方面：一是基团之间的氢键和静电作用等；二是基团之间的空间阻力。功能基的反应活性往往可以通过亲核性来衡量，但有时需要用功能基的超反应性来解释。超反应性是指蛋白质的某个侧链基团与某种修饰剂能够发生超常速度的反应。修饰剂的反应活性则主要取决于修饰剂上活性基团的类型。 1.2 化学修饰的方法 进行蛋白质修饰之前，首先要确定合适的修饰剂，然后再通过实验探索适宜的修饰条件,这主要是为了提高修饰反应的专一性。修饰反应进行过程中，要建立适当的方法对反应进行跟踪监测，修饰后的蛋白质再进行相应的分析和鉴定,以便对修饰效果作出综合的评价。 1.2.1 化学修饰剂 化学修饰剂性能的好坏直接关系到修饰反应效果的优劣。一般地说，选择蛋白质修饰剂要综合考虑如下一些问题[3]：修饰剂的水解稳定性和反应活性；蛋白质的修饰位点，修饰剂与蛋白质上的氨基酸残基之间的反应类型和专一性；要求的修饰度；修饰剂与蛋白质的连接键的稳定性、毒性、抗原性；修饰后是否需要进一步分离；是否适于建立快速、方便的分析方法；修饰剂是否能够简便经济地合成或购买。 目前已经有多种类型的蛋白质修饰剂被研制出来，其中包括小分子修饰剂如乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺等以及大分子修饰剂如聚乙二醇、聚氨基酸、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、多聚唾液酸、葡聚糖、环糊精等。其中小分子修饰剂和大分子修饰剂都能够与某一特定的氨基酸残基的侧链基团发生化学反应，并形成共价键。但小分子修饰剂多用于酶和蛋白质的各级结构和作用机理研究以及蛋白质和酶分子的固定化，而大分子修饰剂则多用于改变蛋白质的免疫学和药物动力学行为，增强蛋白质特别是酶在有机溶剂中的性能等。在大分子修饰剂中，聚乙二醇类修饰剂以其优良的性能而应用最多[4,5]。常用的聚乙二醇类修饰剂见表1[6,7]。
表1 常用的聚乙二醇类修饰剂
mPEG:甲氧基聚乙二醇CH3(OCH2CH2)nOH
1.2.2 修饰反应条件 蛋白质与修饰剂作用的反应条件，除允许修饰过程能够简便易行外,还必须满足如下要求:一是不引起蛋白质的不可逆变性；二是尽可能提高修饰反应专一性。为此，反应温度、pH、反应介质和反应物配比等都要控制在一定的范围。 多数情况下，在蛋白质等电点附近的pH范围内，增加pH可以提高反应速率，降低pH可以减小反应速率。反应活性较高的修饰剂在中性或近中性的pH下即可以与蛋白质迅速偶合；而反应活性较低的修饰剂则需要较高的pH。有些蛋白质属于热敏性蛋白质，修饰反应需要在较低温度下进行。在此情形下，反应时间要适当延长。 有时，反应介质可改变蛋白质的构象或封闭反应部位，因而影响修饰反应。离子强度对修饰反应也会有一定程度的影响，因此需要选择适宜的缓冲剂。其中，磷酸盐和碳酸盐缓冲体系因为与生物体内的缓冲体系接近而应用最多。 一般地，通过改变修饰剂/蛋白质的物质的量的比和改变pH可以迅速地得到对应于特定修饰度的实验条件。 终止修饰反应的方法有：加入某种化学试剂[8](通常为氨基酸)与修饰剂反应，从而消耗掉游离的修饰剂；通过洗滤[9]、超滤或透析将修饰蛋白与未修饰蛋白和游离的修饰剂分开；改变反应条件，如反应的pH值等[10]，使修饰反应停止。 1.2.3 修饰效果评价 对修饰反应评价时至少有三个因素必须考虑：第一，有多少修饰剂已经结合到蛋白质上；第二，哪些氨基酸被修饰剂修饰，修饰度是多少；第三，修饰物中有多少种不同形式的修饰剂－蛋白质偶合物，每种各有多少。 测定修饰度方法有直接法和间接法。直接法中以光谱法最简单和实用，而且还很容易考察修饰反应动力学。但此法要求修饰蛋白具有特异性光谱或其光谱与修饰剂显著差异，而符合该条件的修饰剂很少。 比较容易实现的是间接法。间接法中比较普遍的办法是设法测定已经被修饰的氨基酸的数目。通常采用“TNBS法”(或称Habeeb 法)[11,12]和荧光胺法[13,14]，这两种方法已被证明是用来监测作用于氨基酸的修饰剂对蛋白质修饰程度的最为有效的方法。另一种途径是测定已经减少的修饰剂的量，如用两相体系法[15]、质子NMR[16],和14C标记[17]来检测修饰剂的量。 由于修饰反应的复杂性，要准确测定修饰蛋白的均一性迄今仍然非常困难。质谱[18-20]、核磁共振、SDS-PAGE等都曾先后被尝试用来分析修饰蛋白的均一性。其中以SDS-PAGE技术应用最为普遍。毛细管电泳是另一种有用的分析方法，现已经越来越多地用于PEG蛋白质偶合物分析。最近的研究报道表明该法可以用于确定修饰蛋白中的每一个修饰基团[21,22]。此外，毛细管电泳还可以用于分析碎片化的修饰蛋白确定修饰剂的修饰位点。 2 修饰蛋白在生物医学和生物技术上的应用 当异源蛋白质药物直接注射到人体血液中时，免疫系统可能将蛋白识别为异物，因为大多数实验中的蛋白质来自于其它动物、植物和微生物。因此，病人的免疫系统会对蛋白产生抗体，如过敏反应，严重可能有生命危险。而且，这些免疫系统能缩短药物的循环时间，降低药效。当蛋白质药物进行化学修饰后，免疫学问题就能够得到解决。例如，PEG-蛋白质应该有下列性质：(1)高的酶活性；(2)低的免疫反应；(3)自清时间延长；(4)一定的免疫耐受性。 1990年,PEG-腺苷脱氨基酶偶合物(PEG-ADA)成为通过美国食品和药物管理局(FDA)认证的第一种修饰蛋白[23]。到目前为止，已有多种蛋白质被PEG修饰后被用于生物医学理论和应用研究领域，见表2。
表2 修饰蛋白在生物医学上的应用
肿瘤治疗 | 抗体，天门冬酰氨酶，集落刺激因子，干扰素，白介素
酶的遗传基因缺失症 | 腺苷脱氨酶(ADA)，胆红素氧化酶，嘌呤核苷磷酸化酶，尿酸酶
消炎 | 超氧化物岐化酶(SOD)，过氧化氢酶
抑制免疫反应 | 卵清蛋白
抗血栓 | 抗血凝剂，溶栓酶，前凝血酶，胰蛋白酶，尿激酶
血液代用品 | 血清蛋白，血红蛋白，免疫球蛋白，肌红蛋白，蛋白酶抑制剂
其它 | 碱性磷酸酯酶，胎蛋白酶，核糖核酸酶，大豆胰蛋白酶抑制剂
有机相中的酶催化是目前生物技术中一个非常活跃的研究方向[24][25]，化学修饰同样起着特别重要的作用。氧化还原酶(过氧化氢酶、过氧化物酶、脱氢酶、氧化酶、血红蛋白、肌红蛋白)、水解酶(脂肪酶、胰凝乳蛋白酶 、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶、纤维素酶、a-半乳糖苷酶)等经过化学修饰后在有机溶剂中的溶解度显著增强，尤其重要的是，这些酶得以在有机溶剂中高效地发挥催化作用，从而扩大了酶的应用范围。 3 蛋白质化学修饰的展望 化学修饰改变了蛋白质的性质，如消除了免疫原性和免疫反应性，延长了蛋白质在体内的作用时间，增强了蛋白质的免疫耐受性，提高了蛋白质的应用效率等，从而为蛋白质在生物医学和生物工艺学方面的应用提供了更多机会。 目前，化学修饰仍然存在修饰剂反应活性和/或选择性低，修饰后的蛋白质均一性差、活性低等突出问题。 蛋白质的化学修饰今后的发展方向：(1)研制新型高效的化学修饰剂；(2)建立分析和表征修饰蛋白的简便、准确、灵敏、快速的方法；(3)对修饰过程的机理获得更为清晰的认识。 4 参考文献 [1] 周海梦，王洪睿．蛋白质化学修饰．北京：清华大学出版社，1998, 4-43. [2] 陶慰孙，李惟，姜涌明．蛋白质分子基础．北京：高等教育出版社，1995, 122-157. [3] Harris J M, Zalipsky S. Poly(ethylene) Glycol Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, USA. 1997, 1-474. [4] Inada Y, Furukawa M, Sasaki H et al. Trends Biotechnol., 1995, 13: 86-91. [5] Abuchowski A, Van Es T, Palczuk N C et al . J. Biol. Chem., 1977, 252: 3578-3581. [6] Kodera Y, Matsushima A, Hiroto M et al. Prog Polymer Sci., 1998, 23: 1233-1271. [7] Shearwater Polymers, Inc Quarterly Newsletter, Shearwater Polymers Inc.Huntsville, AL, USA. 1998, 1-4. [8] Zalipsky S, Seltzer R, Menon-Ruoolph S. Biotech. App. Biochem., 1992, 15: 100-114. [9] Beban M, Miller P S. Bioconjugate Chem., 2000, 11(4): 599-603. [10] Lee LS, Conover C, Shi C et al. Bioconjugate Chem., 1999, 10(6): 973-981. [11] Habeeb AFSA. Anal. Biochem., 1996, 14: 328-336. [12] Karr L J, Shafer S G, Harris J M et al. J. Chrom., 1986, 354: 269-275. [13] Guermant C, Baeyens-Bolant B, Looze Y et al. Anal. Biochem., 1995, 230: 254-260. [14] Nag A, Mitra G, Ghosh P C. Anal. Biochem., 1996, 237: 224-231. [15] Jackson C J, Charlton J L, Kuzminski K et al. Anal. Biochem. ,1987, 165: 114-117. [16] Dreborg S, Akberblom E B. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1990,6(4): 315-364. [17] Sharp KA, Yalpani M, Howard S et al. Anal. Biochem., 1986, 154: 110-117. [18] Felix A, Lu YA, Campbell R M. Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46:253-264. [19] Lee S, Winnik MA, Whittal RM et al. Macromolecules, 1996, 29: 3060-3072. [20] Zalipsky S, Mullah N, Harding JA et al. Bioconjugate Chem., 1997, 8: 111-118. [21] Cunico RL, Gruhn V, Kresin L et al. J, Chromotogr., 1991, 559: 467-477. [22] Bullock J, Chowdhurry S, Johnson D. Anal. Chem., 1996, 68: 3258-3264. [23] Levy Y. J. Pediatr., 1988, 113: 312-317. [24] Carrea G, Riva S. Angew. Chem Int. Ed. Engl., 2000, 39:2226-2254. [25] Halling P J, Curr. Opin. Chem Biol., 2000, 4:74-80. 姜忠义 男，35岁，副教授，博士，从事酶和蛋白质工程，膜和膜分离过程的研究。 E-mail:zhyjiang@mail.zlnet.com.cn 2001-01-15收稿，2001-04-04修回