Thyroxine and Deiodinase LIAN Gewei, DING Lan, ZHAO Dqping, NI Jiazuan (Key Laboratory of Rare Earth Chemistry and Physics, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022 China) Abstract Thyroxine, deiodinase and its mimics are reviewed in this paper, the problems in this field are discussed and the trends of the studies in the field proposed. Key words Selenium, Iodine, Thyroxine, Receptor, Deiodinase 摘要 本文对甲状腺素、脱碘酶及其模拟研究进行了综述。评述了本领域中存在的问题，并就脱碘酶、其催化机制及其模拟研究的方向提出了作者的看法。 关键词 硒 碘 甲状腺激素 受体 脱碘酶 甲状腺激素及其脱碘酶 廉革伟 丁兰 赵大庆 倪嘉缵** (中国科学院长春应用化学研究所稀土化学与物理开放实验室 长春 130022) 碘和硒是人体必需的两种微量元素，分别参与了甲状腺素的合成和代谢，对甲状腺素生理功能起决定作用。甲状腺激素主要包裹3,3',5,5'-四碘甲状腺原氨酸(又称甲状腺素，缩写为T4)，3,3',5-三碘甲状腺原氨酸(缩写为T3)和3,3',5'-三碘甲状腺原氨酸(缩写为rT3)。其中低活性的T4是甲状腺的主要分泌物，高活性的T3和非活性的rT3除少量由甲状腺分泌外，主要由脱碘酶对T4的脱碘代谢产生。甲状腺素脱碘酶是能够催化甲状腺激素不同降解反应的一族含硒蛋白。根据其催化机制，反应和抑制动力学及底物特异性不同，甲状腺素脱碘酶可分为三种类型，即I,II和III型脱碘酶(DI,DII和DIII)。 T4通过T3与受体的相互作用对机体的生长发育、形态分化及新陈代谢产生重要影响；脱碘酶能将T4降解为不同产物，对T4的生理功能起调控作用；它们都是生物无机研究的热点领域，本文就甲状腺素的生理功能、生物合成、脱碘酶及其模拟研究进行了综述。 1 甲状腺激素的生理功能 1 生物效应 甲状腺素(T4)，特别是T3进入细胞后通过与特异受体的结合产生多种生物效应[1]，主要是对物质和能量代谢的作用与对生长发育及许多组织器官的影响。 甲状腺激素通过与染色质上的受体作用能促进核糖核酸，脱氧核糖核酸的合成，加速RNA的转录和蛋白质的翻译。适量甲状腺激素能加快糖的吸收和糖原的氧化分解，同时刺激蛋白质、脂肪、纤维素、盐和水代谢等。机体在进行物质代谢同时还进行能量的代谢，甲状腺激素对物质的氧化分解作用促进了机体能量的产生。这些能量一部分用于维持机体的体温，另一部分则用于ATP的合成。甲状腺激素对物质和能量代谢的作用密切相关，相互促进。 甲状腺激素对生长发育和中枢神经系统产生重要影响。胎儿期，甲状腺激素不仅促进身体内各器官的生长发育，而且能促进胎儿的形态分化。成年期缺乏甲状腺激素则引起粘液性水肿，同时表现为反应迟钝，智力减退等。此外，甲状腺激素对心血管、消化和内分泌等系统产生影响。如它可使红细胞的2，3-二磷酸苷油酸生成增多，使氧与血红蛋白的亲和力下降，易于氧的释放等。 1.2 作用机制 目前，甲状腺激素的详细作用机理还不十分清楚，大致是T3通过与细胞核上的酸性蛋白受体结合，从而刺激了转录激活因子活性，增强了靶基因的转录，使mRNA增多，某些蛋白质和酶的合成增加等。甲状腺激素受体(RTs)属于激素核受体超家族(包裹类固醇，维生素D3和类视色素(retinoid X)受体)成员。与类固醇受体相似，甲状腺激素受体可清楚地分为四个区：A/B(1-101位残基)，C(102-169)，D(170-237)和E(238-456)区。C区是受体的DNA结合区，能识别DNA共有的六聚半位点：AGGTCA。此半位点以至少两个或多个拷贝出现在由受体转录激活的基因(启动子区)的激素响应元件(TRE)中。受体能以单体、同源二聚、或与类视色素受体(RXR)生成异源二聚方式结合响应元件。位于C-末端的D/E区是受体的最重要部位，除具有结合甲状腺激素功能外，还包裹一个反式激活区(AF-2)。此反式激活区通过激素结合时的构型变化发挥功能。甲状腺激素不同类型受体(a 1,b 1和 b 2等)的C、D和E区具有高度的同源性，但N-端A/B区完全分化，这可能与N-端(A/B区)调控不同类型受体所特有的活性有关。现已报道[2]这些类型的N-端A/B区也存在另一反式激活区(AF-1)。但不同类型的AF-1活性不同，体现了受体活性之间的差异。近来研究显示：受体的转录激活作用不仅依赖于T3-靶基因启动子区的激素响应元件，而且依赖一组共阻遏蛋白和激活因子存在。缺失T3时，TR与阻遏蛋白(如N-CoR)结合，转录受到抑制；T3的结合导致阻遏蛋白从受体中释放，再结合共激活因子而激活转录。受体的这种结合激活因子功能可能与T3存在时反式激活区构型变化有关。最近，Dace[3]对合成生长激素的GC细胞内甲状腺激素受体进行了研究，然而结果发现，T3对受体的结合导致了受体快速降解，且此降解受到遍在蛋白(ubiquitin)-蛋白酶体降解路线中一种选择性抑制剂(lactacystin)的抑制。进一步研究证实野生型甲状腺激素受体的快速降解必须有结合到受体上的甲状腺激素的存在，此降解经蛋白酶体路线进行；蛋白酶体抑制剂存在下，甲状腺素 b 1受体水平升高，而T3依赖的转录活性和基因表达受到抑制。这表明蛋白酶体调控的受体降解对受体的转录激活作用起新的调控功能。由此推测甲状腺激素的作用机制可能是T3与靶基因启动子区的受体结合，导致了受体构型改变，易于蛋白酶体的降解，生成可结合基因激活因子的活性区(可能是AF-2)，最后激活因子的结合激活了基因转录等。但此推测尚需更多的研究予以证实。 在碘对激素活性的作用方面，刘祁涛等[4]探讨了碘在甲状腺激素与受体蛋白结合中的结构作用并提出了以下的看法：(1)3'-碘基通过与4'-酚羟基分子内直接相互作用控制4'-OH的取向，并使其与受体的His-381的咪唑基形成有效的氢键；(2)3'-碘基通过电子效应促进T3的外酚环与受体C-末端Phe-401的苯环发生有效的芳环堆砌作用，(3)3'-碘基通过与受体的Gly-290和/或Gly-291的羰基氧、Thr-219 的醇羟基氧、Phe-215和/或Phe-218的苯环及Leu-292的烷基等相互作用，使T3外环与Phe-401的芳环堆砌作用稳定化，(4)3,5-碘基通过立体空间阻碍和直接与周围受体蛋白残基作用，保持T3外环空间位置的基本稳定，促进其与Phe-401的芳环堆砌作用。以上观点将有助于甲状腺激素作用机制的理解。 2 甲状腺激素的生物合成 其生物合成需经过以下几个步骤： 2.1 从血中摄取碘 主要有两种途径， 主动运输(过程)：在Na+-K+-ATP酶和腺细胞基膜上“碘泵”的参与下，I-由浓度较低的细胞外液逆电化学梯度转运至浓度较高的腺细胞。此过程中可能有胞膜上磷脂类物质作为I－载体。I-由血浆依靠简单扩散进入腺细胞。 2.2 碘的氧化和酪氨酸碘化 进入腺泡细胞内的I-在过氧化物酶(TPO)和H2O2作用下生成“活性”碘(可能是I＋或EOI)。此活性碘再在过氧化物酶(TPO)作用下与甲状腺球蛋白(TBG)上的酪氨酸残基反应生成一碘酪氨酸(MIT)或二碘酪氨酸(DIT)。TPO在 催化酪氨酸碘化时，可能先与H2O2反应，生成酶的氧化态(E(FeV)-O),I-再与其反应生成酶-次碘酸复合物([EOI]-或EOI＋)，此复合物再催化酪氨酸残基的碘化。TBG分子是一种含有两个亚基的糖蛋白，分子量约660000，约含120～130个酪氨酸残基，其中仅25个左右的残基能发生碘化反应。 2.3 碘化酪氨酸偶联生成T3和T4。 碘化的TBG分子在二硫键、离子键和氢键等作用下形成卷曲螺旋状的二级结构，这样使碘化酪氨酸残基互相接近。在TPO作用下，一个碘化酪氨酸残基失去两个电子成为醌式带正电化合物，它再与相邻的碘化酪氨酸反应生成醌醚中间体，最后脱去一个脱氢丙氨酸生成甲状腺素(图1)。甲状腺素在体内的生物合成是在多种酶的参与下完成的，其过程主要包括H2O2的生成，碘的氧化，酪氨酸的碘化和偶联等(图2)。
| 图1 碘化酪氨酸的偶联机理
| 图2 甲状腺激素的合成路径
生成甲状腺素的TBG分子经胞溢作用排至甲状腺的泡腔中储存备用。当甲状腺受到垂体前叶分泌的促甲状腺激素(TSH)的刺激后，甲状腺上皮细胞经胞饮作用将泡腔中的TBG分子摄入胞内。在胞内溶酶体的蛋白水解酶的催化下将TBG分子水解，释放出甲状腺素分子。它再由扩散作用通过基底细胞膜进入血液循环，供全身各组织器官的代谢并发挥其生理功能。甲状腺激素的合成和分泌受垂体分泌的促甲状腺激素(TSH)和下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素(TRH)的调节。当甲状腺激素低下时，TRH分泌增多，刺激垂体分泌较多的TSH，TSH通过激活甲状腺细胞的腺苷酸环化酶(cAMP)促进甲状腺激素的合成和释放。 3 甲状腺激素的理化性质及其金属配合物 T3和T4的4'-酚羟基的pKa值分别为8.5和6.7，因此生理条件下分别有8.2%的T3和82.4%的T4酚羟基处于去质子状态。由于3和5位碘原子较大的体积阻碍了碳氧醚键的旋转，T4和T3分子内环(inter ring)和外环(outer ring)平面处于接近垂直的空间位置(如图3)，而内环仅有一个碘原子的rT3的内环和外环平面夹角仅为8o和6o。以内环平面作参照，T4又可分为外环与其氨基和羧基在内环同侧的顺式构型和在内环异侧的反式构型。T4 4'-酚羟基具有很强的形成氢键的能力，它可同时作为质子的给体和受体，这可能对T4与受体有效结合产生重要作用。
| 图3 T3和T4的立体结构
| 图4 Cu2+与T4配合物结构
甲状腺激素分子含有氨基，羧基和碘基等基团，能与Cu2+，Zn2+，Mn2+及Mg2+等二价离子生成稳定的配合物。如Cu2+离子能与两个T4分子的氨基、羧基和其中一个分子外环的碘配位，形成一个四方锥结构，其中碘原子位于四方锥的顶端(如图4)。利用Cu2+离子与T4能生成稳定配合物的性质，可以用Cu2+保护T4的氨基制备T4的衍生物。与氨基的有机保护基相比，具有反应条件温和，简单和产率高的特点。 另外，稀土离子(Pr3＋，Eu3＋，Gd3＋，Tb3＋，Yb3＋)在DMSO-H2O混合体系中也能与T4和T3配位[5]，且配位常数从轻稀土到重稀土逐渐增大，在Gd处出现“截断”现象。H NMR研究表明，在较低pH值，T4通过羧基与稀土配位；高pH值时，氨基也相继配位，配位键以离子键为主。聂毓秀等[6]研究发现腹腔注射低剂量稀土(Sm3＋)，一个月后血清中T3和T4的水平明显上升，而静脉注射和灌胃同剂量稀土对血清T3和T4水平无明显影响。甲状腺细胞体外培养发现0.001mmol/L的SmCl3对豚鼠甲状腺滤泡细胞摄碘量及激素的合成与分泌具有促进作用，而0.1mmol/L的SmCl3起抑制作用[7]。低剂量稀土对甲状腺激素分泌的促进作用的机理尚有待进一步研究。 4 甲状腺素脱碘酶 自1952年Gross和Pitt-Rivers于人体血浆中发现T3后不久，很多体内外实验都证实，血浆中的T3主要来自外周T4的脱碘代谢。但直到70年代才证实鼠肝匀浆中T4的脱碘反应是由脱碘酶的催化完成的。以后研究表明，在人和动物的许多组织器官(如肌肉，肝，肾，甲状腺和脑等)中都存在有不同型式的甲状腺素脱碘酶。迄今，人们虽然对其酶学、动力学、结构、硒和T4水平与催化活性的关系等进行了广泛的研究[8]，但直到90年代后Berry等[9-11]才用基因克隆表达的方法证实三种脱碘酶都是含硒酶，由250～280个氨基酸组成，分子量约2.5～3万Da。现已清楚，人和动物血液中约80％的T3来自T4在外周组织中脱碘酶作用下的脱碘代谢，因此，机体脱碘酶的正常与否将对T4的生物功能和生理代谢产生重要影响。 4.1 I型甲状腺素脱碘酶(DI) 4.1.1 一种膜硒蛋白[12] I型脱碘酶(DI)主要存在于机体的肝，肾，甲状腺以及肌肉等。在正常生理条件下，机体血液和大多组织细胞所需的T3主要由DI的催化产生。由于DI存在于细胞膜，含量低(每毫克肝或肾微粒体蛋白中仅含5-20pmol DI)，亲脂性强，纯化易变性等因素，很难用一般蛋白质分离手段提纯得到，这严重限制了DI的结构和活性研究。70～80年代人们一直认为DI的活性中心为半胱氨酸(Cys)残基，但80年代后期研究者发现动物体内T4水平升高与缺硒密切相关。Auther和Bechett等[13]对缺硒和补充硒后鼠的肝脏匀浆脱碘活力比较也表明，缺硒时，DI活力显著降低，补硒后酶的活性恢复，说明硒是DI的必需元素。 1991年Berry等[9]从鼠肝cDNA库中分离到DI的具有2.1kb的互补DNA，并将其在蟾蜍卵子细胞中成功表达，其DNA序列和翻译的氨基酸顺序如图5.所示：由其氨基酸序列可知，编码的蛋白含有一个硒代半胱氨酸(Sec)基团，其cDNA含有一个编码Sec的特殊密码TGA(对应于mRNA中的UGA)，将TGA诱变为Cys密码子TGT，则得到酶的活性仅为原来的10%，表明Sec是DI活性部位所必需的氨基酸。人和狗DI克隆表达和氨基酸序列[14]比较显示，它们有高度的同源性，其cDNA可读框架区都含有编码Sec的TGA密码子,且在mRNA的3′-末端含有必需的Sec插入元件(SECIS)，进一步确证了动物体内的DI为一种膜硒蛋白。
图5 I型脱碘酶的cDNA序列和蛋白一级结构(Se代表硒代半胱氨酸)
4.1.2 结构和酶学性质 由于还未得到DI及其T4复合物的晶体，因此我们现在还无法弄清其高级结构，特别是活性中心结构。但Berry等[15]用拓扑学方法对DI结构和在膜上的取向(如图6.所示)进行了研究。结果表明，它的跨膜区域位于第11-12位的碱性残基与第34-37位的带电残基之间，即由第13-34位的疏水性肽段组成。表达时第2-25位肽段丢失，则酶就失去活性且不能并入细胞膜中。用能够跨入细胞膜的细胞色素P450和DIII的跨膜区取代DI跨膜区后酶的活性也不能恢复。这说明DI N-末端可能存在不十分清楚的信号和终止转移序列。消除第11和12位的正电残基后，酶的活性虽然正常，但其表达量则降低了70%。将第27位的Leu残基变为Met或Glu残基也得到相似结果。这说明第11，12和27位的正电残基虽不是酶的催化活性所必需，但可能是蛋高效表达的需要。含有Sec-126， His-174和Phe-65活性残基的酶催化部位处于细胞的胞质腔中，这可能有利于T4和 rT3等底物的接近。DI的一级结构现虽已清楚，但其高级结构只是用拓扑方法得到了初步结果，尚有待更深入研究予以确证。
| 图6假设的I型脱碘酶在细胞膜上取向图
在还原剂如DTT、GSH等参与下，DI能分别催化甲状腺激素5'-位(外环)和5-位(内环)的脱碘反应(图7)，既能将T4初步降解为高活性的T3和非活性的rT3，又能将其进一步降解为3,3'-二碘甲状腺激素。其中由T4转化为T3和由rT3转化为T2是两个主要的催化途径，如动物血液中T3的生成和rT3的清除主要是由DI催化的。
| 图7三种脱碘酶催化的甲状腺素降解过程
表1 三种脱碘酶的性质
性质 | DI | DII | DIII
反应动力学 | 乒乓 | 顺序 | 顺序
最适底物 | rT3>>T4>T3 | T4>rT3 | T3>T4
最大反应速度 Vm(pmol/(min·mg)* | 1.1×103(rT3) | 35×10-3(T4) | 17.4×10-2(T3)
Km(T4) | 0.1～10 m mol·L-1 | 1～2 nmol·L-1 | 10 nmol·L-1
Km(DTT) | 8 mmol·L-1 | 28 mmol·L-1 | ～70 mmol·L-1
抑制剂： 硫尿嘧碇(PTU) 金硫葡萄糖(GTG) 碘乙酸盐(IAc) Iopanoic acid 类黄酮 卤化芳香化合物 | ++++(Ki～5 m mol·L-1) ++++(Ki:0.05 m mol·L-1) ++++(Ki:2 m mol·L-1) ++++ ++++ ++++ | －(Ki:>1000 m mol·L-1) ++++(Ki :1 m mol·L-1) +(Ki:1000 m mol·L-1) ++++ +++ | －(Ki:>1000 m mol·L-1) ++++(Ki:5 m mol·L-1) +(Ki:1000 m mol·L-1) ++++ ++
分子量 | 27 kDa亚单位 | 29 kDa亚单位 | 31.6 kDa亚单位
组织分布 | 甲状腺、肾、肝、中枢神经系统 | 中枢神经系统、垂体前叶、褐色脂肪组织 | 脑、肝、皮肤、子宫、胎盘等
亚细胞定位 | 肝、肾等内质网 | 微粒体 | 微粒体
甲亢 | 增加 | 减少 | 增加
甲低 | 减少 | 增加 | 减少
低T3综合症 | 减少 | 不变 | 不变
活性部位 | 硒代半胱氨酸 | 硒代半胱氨酸 | 硒代半胱氨酸
功能 | 血浆T3 | 细胞内T3 | T3的清除
* 指每毫克蛋白醇每分钟催化生成多少皮摩尔率物量。
酶学研究表明，DI很不稳定，冷冻保存过程中极易变性失活。在0-37°C随温度上升酶 活性逐渐升高，37°C活性最高，56°C温育10min，则酶几乎全部失活。pH研究结果显示，用T4作底物，其最适pH值在6-7之间。6-丙基-8-硫代尿嘧啶(PTU)，碘乙酸(IAC)和金硫葡萄糖(TGT)等化合物对DI活力起抑制作用，其抑制常数如上表所示。由表可以看出，三种脱碘酶的重要差别就在于PTU能灵敏地抑制DI活性，而对DII和DIII的抑制程度较低。因此，某些甲亢病人，特别是血浆T3高，T4低者，可服用一定剂量的PTU 进行治疗。PTU能与酶催化过程中的中间体酶-碘复合物作用生成不可逆酶-PTU复合物而抑制脱碘酶活性(图8)。PTU 是第二底物DTT的竞争性抑制，而不抑制T4与酶的相互作用。DI 与两个底物的作用是分步进行的，脱碘反应遵从双底物乒乓反应机制。根据DI的稳态动力学和PTU抑制酶活的研究结果，Berry 等[16]提出DI的初步催化机理(如图8)是：还原性的酶与T4反应生成酶-碘复合物，并放出T3，然后此复合物与还原性硫化物(如DTT)反应释放出I－，并恢复酶的还原态。
| 图8 I型脱碘酶脱碘机制及PTU等抑制作用
生物体内DI活性除受硒摄入量的影响外，还与甲状腺状态、肝细胞摄入T4的速度以及还原性共底物的浓度等密切相关。例如，甲状腺功能亢进(甲亢)时，DI的活性和表达量均增高，而甲状腺功能低下(甲低)时，则其活性和表达量恰好相反。这主要与甲状腺激素对DI表达调控有关，它对DI表达起正调控作用。 4.2 II型和III型脱碘酶(DII和DIII) 4.2.1 II型脱碘酶(DII) 以前观点认为，DII不是含硒酶。其主要依据为：(1)硒缺乏虽然降低了甲功正常鼠脑和棕色脂肪组织中DII 活力，但却不影响甲低鼠脑中DII活力。在培养的鼠神经胶质细胞中，缺硒导致含硒谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和DI活力降低，而DII活力不受影响[17]。由此认为，缺硒的甲功正常鼠脑DII活力的降低可能与血浆中高的T4对DII的抑制有关而与硒无关。(2)PTU，GTG，和IAc对DII和Sec突变为Cys的DI的抑制作用均较弱，而对已知的含硒酶如GPX和天然DI有较强的抑制作用。可见，DII的活性中心可能含有Cys而不是Sec。(3)起初从人和鼠中克隆的DII cDNA虽然存在一个与DI位置上相应的TGA密码子，但在2.0kb DII cDNA的3'-末端非翻译区(3'-UTR)未发现硒代半胱氨酸插入元件(selenocysteine-insertion sequence, SECIS)。因此，转录了人和鼠DII cDNA克隆的细胞不产生DII活力。然而，转染了人和鼠DII cDNA与其它含硒酶cDNA 3'-末端非翻译区的嵌合体细胞却具有DII活性。表明此2.0kb的cDNA由于缺乏3'-末端的SECIS元件则不能翻译成含硒蛋白。 后来研究发现，从人和鼠中克隆的2kb DII cDNA仅是完整cDNA(约7kb)的一部分；完整的DII mRNA的3'-末端非翻译区含有一个与DI相似的SECIS元件，能将阅读框区的UGA密码子翻译成Sec；它与第一个UGA密码子相距较远，约5.4kb，是其它含硒酶mRNA的SECIS元件与UGA距离(约1.2kb)的4倍，这样远的距离显著降低了mRNA翻译为含硒蛋白的效率，这可能是造成DII不是含硒酶假象的部分原因。现虽然还不能解释DII为含硒酶的所有问题，但已清楚的是：完整的DII mRNA 能翻译为含硒酶，与其它含硒酶相比，只是翻译效率较低，其3'-末端含有一个SECIS元件，读框区中第一个UGA是翻译Sec的密码子，对哺乳动物DII mRNA来说，较远的UGA与SECIS元件之间的距离极大降低了UGA翻译为Sec的效率。因此，DII mRNA翻译为含硒蛋白的效率远低于在UGA处终止的效率。但与鼠等哺乳动物不同，蛙和鱼等动物体的DII mRNA中UGA密码子与SECIS元件相距较近，因此其翻译为含硒蛋白的效率相对较高[18]。现在还不清楚的是，哺乳动物DII cDNA的终止子TAA上游的第二个TGA密码子翻译为Sec的程度如何？ DII主要存在于中枢神经系统，垂体，棕色脂肪组织和胎盘等。亲和标记分析表明脑细胞膜上的DII分子量约29K Da，是完整的膜蛋白(MW：约200K Da)的一个亚基。DII仅能催化T4和rT3的外环脱碘，而不催化硫酸化甲状腺激素(sulfated iodothyronine)脱碘。对T4的亲和力高于rT3；PTU, ATG和IAc对其抑制作用较差，而番碘酸(Ioponic acid)对其显示较强的抑制作用。与DI和DIII相比，DII具有最低的Km(～10－9mol/L)和Vm(～35fmol/mg Pr·min)值[19]，催化T4脱碘的反应遵从顺序反应机制。人体内约80％大脑皮质，60％垂体前叶及棕色脂肪组织中的T3是由DII生成的，血浆中仅有少量的T3由DII产生。T4浓度对DII活力起调控作用，例如，血液中T4低下时，DII活性升高；T4升高时，则活性降低。这有助于血液中T4浓度发生变化时保证关键组织细胞中T3的稳定。T4对DII的调控一方面可能与T4浓度升高时对DII活力抑制有关，另一方面可能受T3受体调节的影响。 4.2.2 III型脱碘酶 III型脱碘酶(DIII)主要存在于哺乳动物的脑，肝，皮肤，子宫和胎盘等组织中，特别是胎儿的皮肤和肝脏等组织中含量较高。它只催化T3和T4内环的脱碘，遵从顺序反应机制，对T3的亲和力大于T4。在子宫，胎盘和胎儿组织中，DIII可能通过催化T3和T4的分解来保护胎儿发育器官免受甲状腺激素的过度刺激；在成年人和动物体内，DIII可能对血浆中T3的清除和rT3的生成起重要作用。DIII cDNA的克隆表达研究结果[11]显示，DIII也是一种含硒酶，在其保守区存在一个催化必需的Sec残基，其氨基酸序列与DI具有一定同源性。但与DI不同的是，DIII对PTU，ATG和IAc等抑制剂的抑制作用不敏感。与DII相似，动物体内硒缺乏对DIII的生物活性影响很小，这可能与缺硒动物不同组织的硒水平有关。另外，不同含硒蛋白的SECIS 元件及通读UGA密码子所需的蛋白因子的结合效率差异可能也是造成不同脱碘酶对硒敏感度不同的因素。 目前，脱碘酶的研究在许多方面已取得相当大的进展。特别是不同物种，不同组织器官的DII和DIII表达和酶活研究是当前研究的热点。但作者认为其详细的催化机制和空间结构，特别是活性中心结构是亟待解决的问题；另外，克隆表达以及纯化等方面还有许多问题有待更深入的研究。 5 脱碘酶cDNA的克隆表达 脱碘酶cDNA的克隆表达与一般蛋白质相似，其过程主要为：首先从富集脱碘酶的组织匀浆中纯化mRNA即Poly(A)-RNA。然后在寡核苷酸引物和反转录聚合酶等存在下，以mRNA为模板用反转录/聚合酶链反应(reverse transcription/polymerase chain reaction，即TR/PCR)技术克隆出cDNA，组建成cDNA文库；再经多轮筛选和PCR扩增后克隆出脱碘酶cDNA，最后通过载体将其转入真核细胞或蟾蜍卵母细胞进行转录表达，或将体外转录的mRNA直接注射入蟾蜍卵母细胞进行表达。现已得到三种脱碘酶的cDNA序列和推演的蛋白一级结构[9-11]。比较表明，它们cDNA的序列差异虽然较大，但其读框区都含有翻译Sec的TGA密码子，关键氨基酸部位如Sec, His和Phe等的蛋白序列具有高度的同源性。与非硒蛋白mRNA相比，脱碘酶mRNA中的UGA是Sec密码子，而不是终止子，因此脱碘酶的表达具有含硒酶表达的特异性。 首先脱碘酶mRNA的UGA密码子翻译为Sec需要其3'-末端非翻译区硒代半胱氨酸插入元件(SECIS)的参与。三种脱碘酶mRNA的一级结构虽然有很大差异，但3'-末端非翻译区都存在一个或多个约200bp碱基的二级茎环结构序列[20]，它对UGA密码子翻译为Sec起决定作用。若切去此茎环结构或突变茎环结构上的保守碱基序列如AUGA或AAA，则mRNA翻译在UGA处停止，生成的蛋白不含Sec，也无脱碘活性。因此此茎环结构又称硒代半胱氨酸插入元件(SECIS)。它与UGA密码子的距离决定着UGA的翻译效率；距离越近，翻译效率越高；距离越远则越低。研究还发现，将UGA突变为半胱氨酸密码子UGU或亮氨酸密码子UUA后，茎环结构的缺失对突变后的mRNA翻译为完整蛋白不产生影响。这表明，3'-末端非翻译区的茎环结构是UGA翻译为Sec所特有。脱碘酶与硒蛋白P和谷胱甘肽过氧化物酶(cGPX) mRNA的3'-末端非翻译区的序列虽然相差较大，但用硒蛋白P或谷胱甘肽过氧化物酶mRNA的3'-末端SECIS 元件替代脱碘酶mRNA的茎环结构，仍能指导脱碘酶的合成，说明不同硒蛋白的SECIS元件可以互换。 其次UGA密码子翻译为Sec还需要Sec合成酶、硒代磷酸合成酶、携带Sec并识别UGA的tRNA以及特殊的延伸因子等参与。原核生物中，Sec合成酶是由selA基因编码的一种含吡哆醛-5-磷酸辅基的，分子量为50 kDa的寡聚酶[21]。在此酶作用下，连接在tRNA上的丝氨酸的? 氨基与吡哆醛-5-磷酸的甲酰基形成shiff碱，导致2,3-消去反应，脱去一个H2O，形成一个氨基丙烯酰-tRNA，然后再与硒代磷酸反应生成硒代半胱氨酰-tRNA。硒代磷酸合成酶是由selD基因编码的一种37 kDa蛋白，能催化ATP与硒化物(Se2-)反应生成硒代磷酸[22]。基因定点突变揭示，N-端富含甘氨酸区域中的Cys-17和Lys-20是硒代磷酸合成酶保持催化活性必需的氨基酸。携带Sec并识别UGA的tRNA是一种由selC基因[23]转录的特殊产物tRNASeC，它含有一个巨大的额外环，是迄今所知的最大tRNA之一；其氨基接收柄比其它tRNA多一个碱基，并能在其它所有tRNA含有相同碱基的位置上发生变动。但此tRNA不能携带培养基中直接供给的游离Sec，需由Ser-tRNASeC在上述Sec合成酶催化下转化而来。特殊的延伸因子是selB基因的产物[24]，分子量68000Da，在N-端有一个43 kDa的区域，类似于EF-Tu (所有氨酰基-tRNA的延伸因子)，另外还有一个25 kDa的区域，为selB蛋白所特有，能识别硒代半胱氨酰-tRNASeC，并能键合在硒蛋白mRNA的茎环结构上，使得Sec更容易进入蛋白质。同时，它可能具有把硒代半胱氨酰-tRNASeC带到UGA邻近，阻止释放因子2接近核苷酸的A位，而不让UGA翻译为终止子。 不同物种和器官的脱碘酶cDNA克隆表达是当前研究的热点，但表达一般需在真核细胞内进行且表达量很低，因此作者认为脱碘酶的高效表达是今后研究的方向，这将对含硒酶的临床研究及Sec进入硒蛋白机理研究起很大推动作用。 6 抗体酶方法对脱碘酶的人工模拟研究 由于甲状腺素脱碘酶稳定性差，体内含量极微且基因表达量低，所以至今还未得到纯的高活力脱碘酶。因此，开展脱碘酶的人工模拟研究对其结构性质、催化机制的研究和临床应用具有重要意义。 曾有报道[25]用含硒、碲的小分子化合物如NaHSe、苯基硒化氢、NaHTe和苯基碲化氢等对脱碘酶进行了模拟研究。结果表明，苄基硒化氢与4-硝基-2，6-二碘酚在乙醇中回流12 h发生了脱碘作用，并提出了可能的脱碘机制。但小分子化合物不具备天然酶的蛋白部分，无法得到具有象天然酶那样高的活性。抗体酶的出现[26]，为解决天然酶不足和模拟研究提供了新的途径和方法。笔者所在的实验室以脱碘酶的结构和初步催化机制为基础，采用抗体酶技术对脱碘酶进行了模拟研究，制备出了两种具有DI活性的抗体酶Se-4C5和Se-6E8。 首先由T4制备4'-甲氧基O-甲状腺素半抗原，再用戊二醛作偶联剂将T4和4'-甲氧基O-甲状腺素半抗原分别偶联到牛血清白蛋白或卵清白蛋白载体上，制备出全抗原。免疫Balb/c小鼠使之产生抗体，经多步分离纯化和化学修饰，将催化基团Sec引入抗体的抗原结合部位，制备出含硒抗体酶，并用放射免疫法测定抗体酶的催化活性。结果表明，Se-4C5和Se-6E8最大酶活分别为270U和480U，均高于含天然脱碘酶的肾脏匀浆液活力，但还远低于较纯的酶活力。对Se-4C5动力学研究结果表明，其催化的反应速率与底物浓度的双倒数图为一组平行线，PTU对其活力起抑制作用，是DTT的竞争性抑制剂。这说明制得的含硒抗体酶的催化机制与DI的相似，属于乒乓反应机制。 根据I型脱碘酶的初步催化机制及模拟研究结果，我们推测其较详细的催化机制可能是：T4首先和脱碘酶结合，在结合部位催化基团(如苯基，羧基或咪唑基等)参与下，其分子构象发生变化，外环的酚式结构转化成酮-烯醇式结构，使碳-碘键活化，催化基团硒代半胱氨酸(Sec)的硒负离子再进攻5'-位的碘，将碘脱去生成T3，同时脱碘酶被氧化成酶碘复合物(E-SeI)。此复合物再与还原性DTT反应，将酶还原，同时生成I-。这种推测尚有待获得反应中间体产物的证实。 脱碘酶的人工模拟要取得重大进展，笔者认为今后开展以下研究工作很有意义，(1)脱碘酶的结构和详细催化机制研究是其人工模拟研究的基础。由于现在其结构和详细催化机理还不十分清楚，模拟脱碘酶的空间构象和各种催化基团与T4的作用等也就受到很大限制，因此首先需要开展脱碘酶结构和催化机制方面的研究；(2)抗体酶较天然酶稳定且易大量制备，因此脱碘抗体酶研究是天然脱碘酶人工模拟研究的方向。通过半抗原的优化以及用基因突变方法在抗体的抗原结合部位引入Sec和其它催化基团(如His，Cys，Phe等)，将有可能得到活力接近或达到天然酶活力的抗体酶；(3) 鼠源抗体酶应用于临床治疗有关疾病，会引起人体较强的免疫反应，降低甚至消除抗体酶活性，因此需要解决抗体酶的免疫源性问题，制备无免疫源性的含硒人源化Fv片断抗体酶，我们现正开展此方面的研究；(4)随着Sec进入硒蛋白机理的阐明，天然酶基因的高效表达也将是脱碘酶人工模拟研究的重要方向。(5)用分子印迹方法制备具有特异结合T4过渡态功能的高分子材料或蛋白分子，再将催化基团引入结合部位，有可能得到具有催化T4降解活性的模拟物；此方法的优点是能够用化学方法大量制备高分子模拟物，且比蛋白稳定，能在有机相中反应，便于工业化。相信这些模拟研究将有可能开发和研制出临床上有疗效的药物以治疗和预防与甲状腺素有关的疾病。 7 展望 甲状腺激素和脱碘酶的研究虽然已取得了较大进展，但目前仍有许多问题尚待进一步深入研究。例如，甲状腺激素与受体的作用机制及作用后受体怎样激活基因的转录表达问题，甲状腺素浓度对脱碘酶基因表达调控问题，真核生物中Sec进入硒蛋白的机理以及特殊的延伸因子等问题。脱碘酶研究方面，目前主要是对不同物种的脱碘酶进行表达、比较及活性部位催化残基的鉴定等，但其高效表达、稳定性及晶体结构研究还少人问津。在脱碘酶模拟方面，脱碘酶的详细脱碘机理是亟待解决的问题。它是脱碘酶模拟研究的基础，半抗原的设计和优化需在脱碘酶催化的过渡态基础上进行，但是我们现在还不清楚其过渡态的结构，这就给模拟研究带来了很大困难。另外怎样将引入的Sec催化基团恰好定位在与底物5'-碘相互作用的空间位置仍是以后制备高活力模拟物要解决的难题。随着基因工程和蛋白质技术的发展，这些问题将有望得到尽快解决。 8 参考文献 [1] 王夔.生命科学中的微量元素，北京：中国计量出版社, 1992：217-228. 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