Progress in the mass transfer through biofilms CAO Hongbin, ZHONG Fangli, LI Xingang (School of Chemical Engineering of Tianjin University, Tianjin 300072) Abstract Mass transport rates beside/in biofilms directly affect the efficiency of biofilms in many fields. Thus it calls for much attention by many researchers. This paper reviews the recent progress in the study of the structure of biofilm, the effective diffusivity and external mass transfer through the biofilm. Key words Biofilm, Mass transfer 摘要 基质向生物膜传递的速率直接影响到生物膜在许多领域的应用效率。近年来，研究人员对它进行了广泛的研究。本文重点介绍近年来国内外有关生物膜结构和生物膜内、外传质的研究成果。 关键词 生物膜 质量传递 生物膜传质研究进展* 曹宏斌 钟方丽 李鑫钢** (天津大学化工学院化学工程研究所 天津 300072) 生物膜在废水生物处理、微生物发酵、材表面灭菌等领域有极其广泛的应用[1-3]。但直到本世纪60、70年代，人们才逐步开始研究生物膜。本文将对近年来国内外在生物膜结构、基质在生物膜内扩散、基质在生物膜内、外对流传质等方面的研究成果进行详细综述。 1 生物膜结构的研究 生物膜结构是影响基质从主体相向生物膜内传递速率的主要因素之一，因此人们一直非常关注生物膜结构的研究。现有的主要研究方法包括：(1)光学显微镜法；(2)透射显微镜法；(3)共焦激光显微镜法(CSLM)；(4)Fourier变换红外色谱法；(6)原子力显微镜法(AFM)；(6)微探针法；(7)低温切片法；(8)核磁共振法。 经过20多年的研究，人们已初步搞清楚了生物膜的结构。一般认为生物膜是由许多分散的“菌落群”、细胞代谢产物、不溶性固体颗粒和水等物质构成的一层具有流变性质的很不均匀的薄膜[4-9]。作为生物膜的最重要部分，“菌落群”一般仅能覆盖50%左右的面积，在“菌落群”的周围存在各种缝隙、小孔、通道等等。生物膜的不均匀性还表现在，其表层和内部结构有较大差异。据报道[5]，生物膜表层的平均孔径高达1.7～2.7 m m，而其内层的孔径仅为0.3～0.4 m m，孔隙率也从表层的84%～93%降到内层的58%～67%。最新研究表明[7]，生物膜实际是一种有弹性的非牛顿型流体，所以非常容易变形。总之，影响生物膜结构的主要因素可概括为：(1)构成生物膜的微生物[8]。由于每一种微生物都有其自身的特点，所以由不同微生物构成的生物膜，无论是密度还是 “菌落群”的大小或其周围各种缝隙、小孔、通道的形状都不相同。研究还发现，由单一微生物构成的生物膜厚度大多都比较均匀，而由多种微生物构成的生物膜则厚薄不一。(2)培养基质对生物膜的影响[9-11]。实验发现，培养基的种类和浓度对生物膜的厚度影响较大，一般基质浓度升高，生物膜的厚度也要增加。此外如果培养基中碳氮比(C/N)增大，细菌粘性胞外高分子物（EPS）数量也要相应变多。⑶液体的流速[7,12,13]。当生物膜处于流动的液体中时，液体流速越大，生物膜越紧密，生物膜的密度也越大。 由于生物膜结构的复杂性，描述它的数学模型发展很慢。直到最近，人们才开始尝试用数学模型来定量描述[14,15]。到目前为止，现有的模型都首先把生物膜离散化，再结合图像采集系统，计算生物膜内各点的维数，进而描述生物膜内的空隙率、孔径分布等。 2 基质在生物膜内扩散传递的研究 早期人们认为基质在生物膜内仅以扩散的方式进行传递。后经研究才发现，实际上只有当生物膜处于静止的液体中，或液体流速很低时，基质才主要以扩散的方式进行传递。近年来，生物膜内传质的研究主要集中在如何更快捷、更准确地确定基质在生物膜内的浓度分布及测量其实际的传质扩散系数。 2.1 基质在生物膜内浓度分布 生物膜一般很薄，而且结构复杂，故基质在其中浓度分布很不均匀。遗憾的是，到目前为止，除了氧气等少数物质外，研究人员还不能准确知道其它基质在生物膜内的传递情况。现在研究最多的是用微氧电极和显微镜测定氧气通过生物膜时的浓度分布情况。Horn等[16]用微氧电极测量氧气从水中向生物膜内扩散时研究发现，在生物膜表面边界层内，氧气浓度变化比较均匀，一旦进入生物膜内，氧气浓度便迅速下降，等到距离膜表面50～100 m m处，氧气浓度已降到主体相平均浓度的20%以下。实验还发现，主体相液体的雷诺数越大，生物膜内的氧气浓度下降的幅度就越大。Beer等[8]用微氧电极结合CSLM对生物膜内各点的氧气浓度进行了测量。发现氧浓度在生物膜内的分布很不均匀，“菌落群”和其周围空隙中的氧浓度相差很大(如图1)。
| 图1 厚度为160mm的生物膜中氧气浓度分布等高线及梯度分布图
2.2 基质通过生物膜的有效扩散系数De De是定量描述基质通过生物膜传质速率大小的重要参数，测定De的方法大致可分为：扩散法、扩散/反应模型法、微电极/浓度法、核磁共振法和极限电流法等5种。 2.2.1 扩散法 扩散法是通过测量生物膜两侧基质的浓度变化来计算De。Converti等[17]用这种方法测量了葡萄糖通过S. cervisiae生物膜的扩散系数。De用下式求解：
|  | (1)
式中LB为生物膜厚，DT、DM由下列方程组解得：

式中V1、V2分别表示1、2室的体积；S0表示1室溶液的起始浓度；S2表示2室溶液在t时刻的浓度。
Fan等[18]运用非稳态扩散模型对污水中酚在活性碳表面生物膜中的扩散系数进行了测量。他们根据质量守恒定律，分别建立活性碳、生物膜和主体相中酚浓度随时间变化关系式，通过求解方程得出扩散系数。最后他们回归了De与生物膜的密度(Xd)、基质在水中的扩散系数(DW)间的关系：

(2)

除了葡萄糖、酚外，扩散法还可以测量氧气、溴化钠、草酸、氨、亚硝酸和硝酸等通过生物膜的扩散系数，见表1。

表1 生物膜内扩散系数和相关扩散系数的实验结果
基质 |

De
/(×10-9m2·s-1)

De/Dw

生物相

系统

密度
/(kg·m-3)

实验
方法

参考
文献

氧气 | 2.08(22°C) 1.88(22°C) 1.87(22°C) |  | S. cerevisiae | 发酵 介质 | 7.59 30.36 60.71 | 微电极/浓度法 | [2]
| 1.57(22°C) 2.06(22°C) 1.89(22°C) |  | 大肠杆菌 |  | 116.42 13.72 27.44 54.87 |  |
| 1.76(22°C) 1.27(22°C) |  | P. chrysogenum |  | 9.32 18.63 |  |
葡萄糖 溴化钠 |  | 0.8 0.5 0.6 | 混合菌 | 生物 转盘 | 19 26 14 | 扩散法 | [19]
氧气 氨 硝酸 亚硝酸 | 2.55(20°C) 1.39～1.5(20°C) 1.5～1.62(20°C) 1.39(20°C) | 1.2 0.81-0.88 0.9-0.97 0.84 | 硝化细菌 | 好氧 流化 床 | 42～109 | 扩散法 | [20]
葡萄糖 | 0.139(18°C) 0.144(30°C) | 0.16 0.24 | 混合菌 | 复合 膜 |  | 扩散法 | [17]
氧气 葡萄糖 | 0.90(15°C) 0.10(25°C) 0.256(15°C) | 0.5 0.5 0.5 | 混合菌 | 好氧 流化 床 | 23.3 23.5 23.3 | 扩散/反应模型 | [21]
酚 |  | 0.073 0.185 0.736 | 混合菌 | 好氧 流化 床 | 199 144 14.4 | 扩散/反应模型 | [18]
草酸 | 0.275(23°C) 0.54(23°C) | 0.34 0.67 | 混合菌 | 流化 床 | 37.4 37 | 扩散/反应模型 | [22]
氧气 | 0.82(25°C) | 0.34 |  | 滴滤 床 |  | 微电极/浓度法 | [23]

2.2.2 扩散/反应模型法 这种方法综合考虑处于稳定状态的生物膜系统的传质和生物反应，以质量守恒为依据，建立传质和反应的平衡关系。通过求解模型方程得到基质通过生物膜的平均扩散系数。Onuma等[11]用这种方法测量了葡萄糖和氧气在生物膜内的扩散系数。假设基质反应是零级，

De可用下式求解：

|  | (3)

其中： |  |

式中，V是内室的体积，A是扩散面积，L是滤膜厚度，S0是外室初始浓度，Si是内室t时刻的基质浓度。
他们研究发现，培养基中的碳氮比(C/N)、生物膜的密度和环境温度对De都产生影响：C/N变大、生物膜密度增大或温度降低时，De都要降低。最后他们分别拟合了葡萄糖、氧气的De与它们在水中扩散系数DW,20(20°C)、生物膜的密度ρ和环境温度t等之间的定量关系：

| 葡萄糖： | (4)

式中：DW,20为葡萄糖20°C时的扩散系数。

| 氧气： | (5)

式中：DW,20为氧气20°C时的扩散系数。

2.2.3 微电极/浓度法 微电极-浓度法是利用基质在生物膜中扩散系数与电极电位间的关系来测定De。目前主要用这种方法测定氧气在生物膜中的扩散系数。氧气在生物膜中扩散系数与氧电极的电极电位关系为：

|  | (6)

式中：ke、k0-氧气在生物膜、水中的溶解度
Ra、Rs-氧电极在空气、生物膜中读数
de、dm-生物膜、氧电极膜厚度
Ho等[2]用微电极-浓度法分别研究了氧气在S.cerevisiae、E.coli和P.chrysogenum等形成的生物膜中的有效扩散系数。结果发现，随着生物膜中“菌落”所占的比例f升高，De在不断降低(见表1)，而且它们之间存在如下关系：

(7)

式中：A1、A2是细胞形状、氧气在细胞内和在介质中扩散系数之比的函数。
2.2.4 核磁共振法 核磁共振法是根据基质在生物膜中不同位置的运动特性不同来进行测量的。Beuling等[24]应用脉动场梯度-核磁共振法准确地测量出水和葡萄糖在不均匀生物膜内的扩散系数。
2.2.5 极限电流法(LCT) 极限电流法是让电极表面进行特殊电化学反应，并使之产生极限电流。通过极限电流与扩散系数的关系，间接计算扩散系数。Beyenal等[13]用不同浓度的琼脂胶制成薄膜，先用扩散法测定Fe(CN)3-6在每一种浓度的琼脂胶薄膜中的扩散系数，再把微电极伸入这些膜内标定对应的电流密度i，由此得到De与i间的关系：

|  | (8)

以该曲线为标准，作者分别测量了Fe(CN)3-6在两种生物膜(一种由P.Aeruginosa形成，另一种由P.aeruginosa、P.fluorescens和.Pneumoniae三种混合菌形成)中的扩散系数。测量发现，基质在单一细菌形成的生物膜中扩散系数比较稳定，而在多菌种形成的生物膜中的扩散系数波动很大。作者还发现[25]，基质浓度及液相流速对扩散系数都有较大影响，基质浓度越大，流速越低，扩散系数越大。Yang等[26]把可移动的微电极伸入生物膜内测定氧在平板表面生物膜内三维浓度分布，发现氧在含多菌种的生物膜的传质系数波动较大，而在单一菌种的生物膜的传质系数比较稳定。
以上5种方法各有特点。扩散法和扩散/反应模型法可用来测量各种基质通过生物膜的扩散系数，但只能得到基质通过生物膜的平均扩散系数；微电极/浓度法和LCT法能够把微电极伸入生物膜内部测量基质在生物膜内各点的扩散系数，但它们测量范围有限，微电极/浓度法只能测量氧气等极个别基质在生物膜中的扩散系数，而LCT只能测量Fe(CN)3-6在生物膜的扩散系数。核磁共振法的测量范围也非常有限。另外，从表1不难发现，无论基质是分子还是离子，无论构成生物膜的微生物性质如何，基质在生物膜中的扩散系数都随着生物膜密度增大而下降。大部分分子在生物膜中的扩散系数只是其在水中的10%～90%。但有些离子在生物膜中的扩散系比其在水中扩散系数还要高，这可能是由于微生物细胞表面带电的原故，具体原因还需进一步研究。
影响基质向生物膜扩散的因素与De之间关系如何？由于微生物结构复杂，人们对此方面的研究至今还停留在以实验拟合为主。不过有人已开始从理论上研究影响扩散系数的因素。Hoyle等[6]研究发现，除了温度、微生物密度外，EPS也能阻碍基质向生物膜扩散、细胞的可透性也对扩散系数影响很大。Hinson等[5]以Maxwell方程为基础，综合考虑以上各种影响因素从理论上推导了De的表达式：

|  | (9)

式中a,b是反映EPS量、细胞可透性等的参数。

3 基质在生物膜内、外对流传质的研究
生物膜在介质表面分布一般都不均匀，而且膜内存在大量形状各异的缝隙、小孔和通道，所以当生物膜处于流动的液相中时，除了生物膜表面的液体处于流动状态外，生物膜内的缝隙、小孔、通道中的液体一般也处于流动状态[7,12]。Bouwer认为生物膜的这种“粗糙”结构至少有以下3个优点[27]：(1)增加生物膜表面对流传质速率；(2)缓冲流体对生物膜的剪切力；(3)增大了接触面积。Lewandowski等[4]用微粒示踪结合CSLM、核磁共振(NMR)测定生物膜对平板表面水流情况的影响。发现当主体相水流速度小于2.4cm/s时，生物膜对水的流型几乎没有影响，但当水流速度达到4.0cm/s时，生物膜将改变水流的流型，但在距离培养基1000m m以外的地方，水的流速几乎不受生物膜的影响。生物膜内的水流速度梯度与主体相流速密切相关。有生物膜时，培养基表面的水的速度梯度仅为无生物膜时速度梯度的一半左右。
基质从主体相到生物膜内“菌落”表面的传质受生物膜结构、水的流动情况和生物膜的内扩散系数等影响，所以研究起来就更为复杂，到目前还没有特别的方法。已报道的研究方法包括微电极/传质法、传质/反应模型法和极限电流法(LCT)3种。
3.1 微电极/传质法
该方法用微电极测量基质在边界层及生物膜内浓度分布，并根据对流传质与扩散传质平衡求解。Horn等[16]对管式反应器中氧气从水相进入生物膜的外传质进行了较为详细的研究。他们通过测定生物膜内氧的分布情况，用下式求出外传质系数KL：

|  | (10)

实验发现，与没有生物膜的相同装置对比，生物膜的存在能把外传质系数提高一倍以上。最后拟合了Sh数与Sc和Re的关系式，见表2。
3.2 传质/反应模型法
传质/反应模型法是利用传质和反应达到平衡时的关系式来计算传质速率。这种方法需要预先知道一些参数。这种方法比较简单，所以许多文献都用它来测量固/液传质系数[5,6,28]。Nicolella等[28]用三相流化床测定了氧气从污水中向陶瓷表面生物膜内的传质系数k。他们根据氧气从水中向生物膜表面传质通量等于生物膜反应消耗氧气的通量，计算出k。实验还发现，气体流速、粒子填充率和粒子大小对k都有影响。一般空气流速增大，k也相应升高，当粒子的填充率由5%增至15%或其粒子直径由0.5mm增至2.0mm时，k都略有下降。最后他们也拟合了Sh数与Sc和Re的关系式，见表2。
3.3 极限电流法(LCT)
与测量基质通过生物膜扩散系数相似，LCT用于测量对流传质速率也是让电极表面进行特殊电化学反应，并产生极限电流。通过极限电流与传质系数的关系测定k。K与电流I、电极面积A及电极表面基质浓度C0有下列关系：

|  | (11)

Stoodley等[12]用直径为0.282mm，浓度为1×107个小球/mL的荧光乳汁球作为示踪剂结合CSLM测量了生物膜内液体的流动，发现与主体相液体相比，液体在生物膜内小孔中流速一般很低。在此基础上，他们用LCT测量了生物膜内小孔中的k。测量发现，基质在生物膜内“菌落”周围空隙内的传递速率几乎不受菌落的影响，当主体相为层流时，在生物膜内菌落表面液体流速为零，传质系数为0.01cm/s；而菌落周围空隙内液体流速一般不为零，当液体流速为0.3cm/s时，传质系数增大为0.017cm/s。最后他们用半理论传质方程拟合两种流速(2.3cm/s、4.0cm/s)下，Sh与Re和Sc的关系式，见表2。
Yang等[28]用LCT法对生物膜内不同位置的小孔中的k进行测量，测量结果见图2。由图可见，在远离生物膜表面的地方(如距平板1000mm)，k与测量位置无关。但随着向生物膜表面靠近，k开始受位置的影响，等到达生物膜内部(如距平板50mm)时，位置对k影响已很大了。如果把到平板距离相等的传质系数取平均值kaver，那么随着距离增大，kaver随主体相液体流速增大而升高越多。
以上3种方法各有特点，微电极/传质法和传质/反应模型法方法简单，但只能测量基质从主体相向生物膜表面传质的传质系数，LCT法能测量生物膜内的传质系数，但该法比较复杂，而且还需要显微镜观察。

表2 传质系数与液体流速间关系
表达式 | 适用范围 | 参考文献
| 氧气，直管， 500<Re<2200 | [16]
| 平板，生物膜内， 0<Re<0.2 | [12]
| 流化床，103<Re<107 | [28]
| 平板 | [29]
| 生物转盘 | [29]

| 图2 传质系数沿水平方向分布图 (主体相液体平均流速1.58cm/s) a z=1000m m; b z=300 m m; c z=200 m m; d z=50 m m;

4 结束语
随着生物膜应用的日益广泛，其内部结构和内、外传质机理的研究就愈发显得重要。只有搞清楚生物膜的传质过程及其传质机理并建立相应的传质模型，才能够寻求强化生物膜传质的途径，进而研制出高效灭菌设备，使灭菌更完全、更彻底，并大幅度提高废水、废气的生化处理效率，减小微生物发酵设备体积，使生物膜在各个领域得以更充分、更高效的利用。

5 参考文献
[1] 余淦中. 北京:中国环境科学出版社, 1992.
[2] Ho C S, Ju L K. Biotechnology and Bioengineering, 1988, 32: 313-325.
[3] Costerton J W. Biomedical Instrumentation and Technology, 1997, 5/6: 222-226.
[4] Lewandowski Z, Stoodley P, Altobelli S. Water Science and Technology, 1995, 31(1): 153-162.
[5] Zhang T C, Bishop P L. Water Research, 1994, 28(11): 2267-2277.
[6] Hoyle B D, Wong C K, Costerton J W. Canadian Journal of Microbiology, 1992, 38: 1214-1218.
[7] Stoodley P, Lewandowski Z, Boyle J D et al. Biotechnology and Bioengineering. 1998, 65(1): 83-92.
[8] De Beer D, Stoodley P. Roe F et al. Biotechnology and Bioengineering, 1994, 43(11): 1131-1138.
[9] Hinson R K, Kocher W M. Journal of Environmental Engineering, 1996, 122(11): 1023-1030.
[10] Costerton J W, Irvin R T, Cheng K J. Annual Review of Microbiology, 1981, 35: 299-324.
[11] Onuma M, Omura T, Umita T et al. Biotechnology and Bioengineering, 1985, 27: 1533-1539.
[12] Stoodley P, Yang S, Lappin-Scott H et al. Biotechnology and Bioengineering, 1997, 56(6): 681-688.
[13] Beyenal H, Tanyolac A, Lewandowski Z. Water Science and Technology, 1998, 38(8-9): 171-178.
[14] Picioreanu C, Loosdrecht M C, Heijnen J J. Biotechnology and Bioengineering, 1998, 58(1): 101-116.
[15] Lewandowski Z, Webb D, Hamilton M et al. Water Science and Technology, 1999, 39(7): 71-76.
[16] Horn H, Hempel D C. Water Science and Technology, 1995, 32(8): 199-204.
[17] Converti A, Casagrande M, de Giovanni M et al. Chemical Engineering Science, 1996, 51(7):1023-1026.
[18] Fan L S, Leyva-Ramos R, Wisecarver K D et al. Biotechnology and Bioengineering, 1990, 35: 279-286.
[19] Siegrist H, Gujer W. Water Research, 1985, 19:1369-1378.
[20] Williamson K, McCarty. Journal Water Pollution Control Fed, 1976, 48: 9-22.
[21] Fujie K, Tsukamoto T, Kubota H. Journal of Ferment Technology, 1979,57: 539-545.
[22] Wang S-C P, Tien C. AIChE J, 1984,30: 794-801.
[23] Bungay H R. Biotechnology and Bioengineering, 1969, 11: 765-772.
[24] Beuling E E, Dusschoten D, Lens P et al. Biotechnology and Bioengineering, 1998, 60(3): 283-291.
[25] Beyenal H, Lewandowski Z. Water Research, 2000, 34(2): 528-538.
[26] Yang S, Lewandowski Z. Biotechnology and Bioengineering, 1995, 48(6): 737-744.
[27] Bouwer E J. Water Research, 1987,21: 1489-1498.
[28] Nicolella C, Loosdrecht M, Heijnen J. Chemical Engineering Science, 1998,53(15):2743-2753.
[29] Grady C P, Lim H(李献文等译). 北京：中国建筑工业出版社, 1989, 352-362.

曹宏斌 男，30岁，博士生，从事生物传质方向的研究。 **联系人
国家自然科学基(29976030)和教育部骨干教师资助项目。 2000-03-13收稿，2000-070-17修回。