Recent Development on Enzymatic Catalysis in Eutectic Solid-to-Solid Mixtures of Substrates Chai Benzhong, Hu yonghong, He yi, Ouyang Pingkai, Shen Shubao (College of Life Science and Pharmacy, Nanjing University of Chemical Technology, Nanjing, 210009) Abstract Enzymatic catalysis in heterogeneous eutectic solid-to-solid mixtures of substrates is another new enzymatic reaction technology, which was developed from conventional enzymatic reactions conducted in aqueous or organic solution in early 1990s. Compared with the later two enzymatic reactions, it has many advantages, likely high concentration of reactive substrates in a reaction solution, good product yield and reaction rate, simpler product separation and low pollution to the environment. It is known as an extremely prospective technology toward a new clean reaction technology. This paper firstly made a brief review on the reaction principle, application, and important factors about enzymatic catalysis in heterogeneous eutectic solid-to-solid mixture of substrates. Finally, the scale-up possibility and some important technical problems are analyzed. Key words Eutectic mixture, Enzymatic reaction, Solid-to-solid system 摘要 将对低共熔固-固底物体系中的酶促反应的基本原理、应用、主要影响因素及热力学和动力学作一简介，并分析该类酶促反应技术的工业放大可能性及主要要解决的问题。 关键词 低共熔 酶促反应 固-固体系 低共熔固-固底物体系中酶促反应的研究进展* 柴本忠 胡永红 何毅 欧阳平凯 沈树宝** (南京化工大学制药与生命科学学院 南京 210009) 低共熔状态是由两种或多种固体化合物混合而得到的具有一个最低共熔点的状态，在低共熔点温度附近发生的酶促反应就称为低共熔固-固体系中的酶促反应。此反应的最大特点就是反应所需的液相不象常规水溶液或有机相中的酶促反应靠加入大量的水或有机溶剂产生，而是靠反应底物形成低共熔点产生，因而其反应体系的液固体积比(或重量比)远小于水溶液或有机相体系，从而带来反应底物浓度高、反应速度快、产物收率高、浓度也高，而且反应体积小，大大降低了产物分离提纯的成本，也因不用或极少用有机溶剂而大大降低了对环境的污染及回收有机溶剂的成本。它是一个极具潜力的清洁反应新技术。 然而找到既适合酶促反应对温度及酶活的需要，又符合严格的物化概念上的低共熔二元反应底物体系，实际上是很难的。因此往往通过加入极少量的第三、第四液相组份来产生反应所需的液相形成固-固-液悬浮体系[1]或一种反应底物以液态存在，另一种反应底物为固相形成的液-固悬浮体系。但上述固-固-液悬浮体系中加入的液相组份必须促进多组份体系的低共熔形成或对反应底物有适度的溶解性，又不影响酶活及酶的催化选择性，而且加入量尽可能少以保持很高的反应底物的浓度。鉴于此，有人将上述两种悬浮体系称为拟低共熔体系或固-固反应体系[1]以区别于常规的水溶液体系和有机溶剂体系，这些体系还是保留了严格物化意义上的低共熔反应底物体系的主要特点：反应底物浓度高、液固比小。而本文则用低共熔固-固体系来加以描述，以体现该类酶促反应底物体系的由来和主要特征，而在该类体系中发生的酶促反应技术则相应称谓低共熔酶促反应技术。 低共熔固-固底物体系的酶促反应，并不是说这类酶促反应不需要任何液相就可以进行。相反这类体系的酶促反应没有液相也是不可能发生的，液相存在是必须的。Lopez[5]等用PM和FTIRM技术证实了在低共熔固-固底物体系中发生酶促反应液相的存在。 低共熔酶促反应反应技术是九十年代初继常规的水溶液中酶促反应及有机相中酶促反应发展起来的又一酶促反应新技术，由于它具有上述比常规水溶液体系及有机溶剂体系的诸多优点，因而越来越引起国内外研究者的关注[1-10]。下面将就该新技术的应用、主要影响因素及热力学和动力学等作一简介和评述。 1 低共熔固-固底物体系酶促反应技术的应用 Lopez-Fandino[5], Bjorup[17], Kasche[18], Nakanishi[19], Kuhl[20], Eichhorn[21], Jakubke[22], Erbeldinger[1]等采用低共熔酶促反应技术，用蛋白酶合成了许多具有生物活性的寡肽的前体。笔者[23]也用该技术合成了苄氧羰酰-L-天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯，其产物收率超过95%，而且有机助溶剂用量极少，明显高于用其它方法制备的文献结果。用低共熔酶促反应合成活性肽的部分例子见表1。
表1 用低共熔酶促反应技术合成活性肽部分实例
肽 | 乙酰供体 | 乙酰受体 | 酶 | 助溶剂 | 时间/h | 收率/%
N-Z-L-Tyr-ArgNH2 | N-Z-L-Tyr-OEt | L-ArgNH2 | a-CT | 12%W,12%E, 18%MEA | 48 | 59
N-Z-Aspartame | N-Z-L-AspOH | L-PheOMe | Th | 12%W,8%G | 2 | 84
N-Ac-L-Phe-LysOEt | N-Ac-L-PheOEt | L-LysOEt | a-CT | 8%W,8%G | 15 | 44
N-Phe-LeuNH2 | L-PheOEt | L-LeuNH2 | Sub | None | 60 | 78
N-Phe-LeuNH2 | L-PheOEt | L-LeuNH2 | Sub | 4%W,8%G | 10 | 89
N-Z-Gly-Phe-LeuNH2 | N-Z-GlyOH | L-Phe-LeuNH2 | Th | 7%W,7%G, 14%AN | 24 | 86
N-Z-Gly-Phe-Leu-NH2 | N-Z-GlyOEt | L-Phe-LeuNH2 | Pap | 4%W,9%E | 48 | 41
N-Z-L-Tyr-Tyr-NH2 | N-Z-TyrOEt | L-TyrNH2 | a-CT | 12%W,12%E, 18%MEA | 5 | 81
N-Z-L-Met-Tyr-Tyr-NH2 | N-Z-L-MetOEt | L-Tyr-TyrNH2 | P-K | 22%W,22%E | 2 | 89
N-Ac-L-Tyr Gly Gly OEt | N-Ac-L-TyrOEt | L-Gly-GlyOEt | a-CT | 6%W,6%G, 12%E | 20 | 67
N-TFAc-L-Tyr-Gly-Gly-OEt | NTFAc-L-TyrOEt | L-Gly-GlyOEt | a-CT | 6%W,6%G, 12%E | 20 | 62
N-Ac-L-[leu5]-enkephalinamide | N-Ac-L-Tyr-Gly- GlyOEt | L-Phe-LeuNH2 | P-K | 3%W,7%F, 14%AN | 20 | 40
Z-Aspartame | Z-L-AspOH | L-PheOMe | Th | 8%W,6%B | 2 | 95
N-TFAc-L-[leu5]-enkephalinamide | N-TFAc-L-Tyr- Gly-Gly OEt | L-Phe-LeuNH2 | P-K | 3%W,7%F, 14%AN | 20 | 38
注：AN-乙腈 E-乙醇 F-二甲基甲酰胺 G-甘油 W-水 MEA-醋酸二甲氧基酯 Th-嗜热蛋白酶 a-CT-a-胰凝乳蛋白酶 P-K-蛋白酶K Sub-枯草杆菌蛋白酶 B-丁二醇
Cao[14]等也应用低共熔酶促反应技术合成了一系列糖脂。另外，Wolf[15,24]等和Xin[25]等也应用该技术对一些生物活性物质(诸如消旋萘普生等)进行了动力学拆分的制备研究。Piera[26]等则将它应用到一些特殊的表面活性剂(Gomini)合成上。原则上，凡是在以往水溶液中或有机相中进行的酶促反应，均有可能采用低共熔固-固底物体系酶促反应技术来进行。关键在于寻找相应合适的酶促反应条件，使反应底物在液相中浓度尽可能高，又不降低酶的催化活性及立体选择性。 2 影响低共熔固-固底物体系酶促反应的主要因素 2.1 水的作用 Kuhl[9]等和Klibanov[16]等认为水是维持蛋白酶催化活性所必须的。Erbelding[11]等研究了在低共熔固-固体系中，水对嗜热蛋白酶催化Z-Gln-OH和Leu-NH2底物固-固合成二肽的影响。水含量的范围控制在每摩尔反应底物0～600毫升水。他们发现当水量降低至每摩尔底物40毫升时，反应初速率增加了近10倍，低于这个值时，反应初速率降低了许多，在绝对无水体系中，反应初速率为零。他们认为应从传质和酶活两个方面来考虑水量变化对酶促反应的影响。实验表明，当水量高于反应初速率最大值的水量时，传质受到限制。当水量低于反应初速率最大值的水量时，水量对酶活有显著影响。因此，水是低共熔酶促反应进行所需液相的主要组成。绝对无水的条件下酶促反应是不可能发生的。对不同的酶及不同的反应底物体系，其水的最佳加入量也是不同的，必须结合具体体系实验摸索。 2.2 助溶剂的作用 助溶剂指的是低共熔反应底物体系的改性剂，主要是有机或无机液体，加入量极少。目的在于改进底物的物化性质，维持酶的活性。特别是改变液相底物的比例、组成、粘度和固相的分散度等[5]。 Lopez-Fandino[5]等研究了助溶剂在低共熔底物体系中所起的重要作用。用实验证明了液态或半液态低共熔状态的存在是低共熔固-固底物体系酶促反应发生的必要条件。这些助溶剂的加入促进了低共熔体系液相的形成，提高了液相的比例，并改变了液相的组成和性质。结果极少量助溶剂的加入显著提高了反应速率和反应收率。随后还系统地研究了各种助溶剂与底物间的不同作用方式，如极性、亲水性、氢键形成能力对低共熔状态的形成和组成、液相性质和结晶产品的形成和速率的影响。得到的结论是反应介质中的液相对反应起到了支配作用，少量液态助溶剂的加入可以控制低共熔混合物的性质和液相比例，助溶剂对反应机理的作用很复杂。在所研究的助溶剂中，亲水产氧助溶剂对这类反应的的影响最显著。笔者[23]也在合成苄氧羰酰－L－天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯时，研究了系列醇类化合物(包括单元醇、二元醇及三元醇)作为助溶剂的作用及变化规律。找到了一些二元醇既可保持酶活和酶的立体选择性，又对底物有适度溶解性能，并能控制体系粘度在较低的范围，减小扩散传质阻力影响。 2.3 底物比例的影响 在第三组份存在的情况下，底物比例改变显著影响液相组成和反应速率。Erbeldinger[12]等研究了不同的底物比例情况下的低共熔酶促反应。实验中，发现底物配比对反应速率有显著影响。在Leu-NH2和Z-Gln的反应中，过量Leu-NH2时，反应初速率增加极大。而Z-Gln过量时，反应初速率下降很多。这表明反应发生在液相，底物比例的较小变化就会对反应速率有较大的影响。 2.4 液相形成方式 Gill[10]等采用先加热反应底物体系再降温形成低共熔点的方法来产生反应所必须的液相。而Kuhl[4]等则采用加入第三组份助溶剂构成固-液悬浮体系产生液相，Kuhl[4]等通过加入极少量盐水化合物控制水含量。似乎Kuhl等的方法更具普遍实用价值。 2.5 反应体系混合方式 液-固体系中的反应其体系混合程度至关重要。目前在低共熔固－固反应体系试管加超声波处理或振荡，搅拌桨式反应器及流化床反应器三种形式。笔者认为由于搅拌式反应器特别适用于高粘度固液混合物的混合，所以设计精巧搅拌桨的搅拌式反应器应有更好的工业应用价值。除了上述几个参数外，与其它所有酶促反应一样，温度、pH及酶浓度等因素也影响该类酶促反应。 3 低共熔固-固底物体系酶促反应的热力学 Halling[6]等首次对低共熔固-固底物体系合成肽类化合物的酶促反应作了比较系统的热力学分析。以下式的蛋白酶催化两底物体系酶促反应为例。 式中A代表Y-Xaa1-OH，B代表H-Xaa2-Y'或HO-R(R是烷基残基)，AB代表Y-Xaa1-Xaa2-Y'或Y-Xaa1-OR。Y和Y'任何保护基，Xaa1和Xaa2是氨基酸。 该反应的平衡常数为： 式中as代表每一种组分在反应介质中的热力学活度。aw表示水的活度。 当除水以外的三种组分以固态形式存在时，这三种反应物在整个反应液相介质中的浓度应为常数，而与固体的量或所选择的助溶剂无关。此时上述平衡常数式可以写作 式中ao表示纯固态组分的活度。 此时唯一的变量是水活度aw，其变化与平衡方向变化相一致。水活度大小起到了一种调节整个反应方向及速率的开关作用。影响水活度大小的主要因素为水含量、反应底物的性质及在液相中的溶解度和所加入的助溶剂性质及浓度。改变助溶剂的种类及浓度将有效调节水的活度。Halling[6]等以平衡常数为基础建立了一种线性数学模型。并用实验数据加以检验和分析。所作的热力学实验和理论分析结果表明这种固-固反应，在给定的水活度下，助溶剂的作用主要影响反应底物的溶解性，对整个反应平衡收率没有影响。当反应平衡收率最大时，所选择的助溶剂应对反应底物有最小的溶解度。但助溶剂的种类及浓度变化会改变水的活度，从而可以用助溶剂的种类或加入量来调节反应平衡。然而Halling等人在作上述分析时，没有给出低共熔固-固底物体系中各组份的活度系数如何计算。针对这一问题，笔者[23]正在开发将UNIFAC基团贡献法推广应用到低共熔固-固底物体系中各组份活度系数的预测。特别对在多种不同底物、不同助溶剂下水活度的预测进行研究。目前主要研究体系为水+氨基酸(或氨基酸衍生物)+醇。如果能得到精确的预测模型，则更有利于深入探讨助溶剂种类及用量的选择，归纳出更具普遍意义的选择原则。 4 低共熔固-固底物体系酶促反应的动力学 动力学主要研究影响宏观反应速率的因素及相应提高反应速率的措施。宏观反应动力学过程主要包括固相底物的溶解、液相内扩散传递、本征酶促反应及可能的产物结晶沉淀这四步。整个宏观反应速率是上述几种分步速率的综合体现。有人[1,5,13]研究了用嗜热蛋白酶合成Z-Phe-Leu-NH2时液相对宏观反应速率的影响，实验中发现加入粘性的蔗糖使反应体系粘度增加，相应的反应速率下降。因而在低共熔固-固底物体系中加入少量的助溶剂不仅会影响液相组成及水的活度，而且对液相的物化性质变化影响很大，所以从这个意义上讲助溶剂的加入，对改变低共熔固-固底物体系酶促反应宏观动力学行为起到了十分重要的作用。Erbeldinger[11]等则研究了嗜热蛋白酶合成肽类化合物的宏观动力学。当反应体系的水量变化时，会对宏观反应速率有很大影响。高含水量时宏观反应速率低，是由于存在液相传质阻力，低含水量时则宏观反应速率提高。但当含水量低于某一临界值时，则酶几乎没有活性，宏观反应速率为零。因此水含量不仅影响反应平衡，而且很多情况下也对反应宏观动力学影响很大。此外底物溶解能力也直接影响低共熔固-固底物体系酶促反应宏观速率[1]。Wolff[15,24]等研究了低共熔固-固底物体系酶促反应用于若干生物活性物质的动力学拆分时的宏观动力学，并构建了较为合理的宏观动力学方程，用实验检验，取得了较好的预测结果。 总之，影响低共熔固-固底物体系酶促反应宏观动力学因素很多，而且往往与保持酶活和酶的立体选择性有不一致的情况。最终反应条件的确定则必须依据使反应产物得率尽可能高及反应时间尽可能短的原则来选择。 5 低共熔固-固底物体系的酶促反应的反应器研究及工业放大 许多人根据低共熔固-固底物体系的酶促反应的特点，考虑了其工业放大的可能性。Eichhorn[7-8]等首次将此技术由毫摩尔级扩大至摩尔级，并使用搅拌式实验室反应器，合成Z-Aspartame的收率达90％以上。Kuhl[9]等采用的是流化床反应器，用胰凝乳蛋白酶合成Z-Phe-Leu-NH2和用嗜热蛋白酶合成Z-Ala-Phe-Leu-NH2，转化率仅为30%～50%。因为反应底物主要以固相形式存在并与液相的反应底物处于溶解平衡，所以保持反应底物的高浓度和反应体系的良好混合是该技术的主要特点，也是这类酶促反应器工业放大研究中重点要关注的课题。 6 小结和展望 低共熔固-固底物体系酶促反应新技术的核心思想是在保持酶活和酶的立体选择性前提下，尽可能提高反应底物的浓度，促进平衡向生成产物方向移动，并大大提高反应速率和产物得率。由于此类酶促反应必须在液相中进行，因而研究助溶剂如何促进反应体系的低共熔形成及尽力提高反应底物的液相浓度有十分重要的理论和应用价值。为此必须深入研究低共熔固-固底物体系酶促反应的热力学及宏观动力学，特别是各种助溶剂的影响。还要深入研究水的作用，水不仅是维持酶活所必须的，又是反应的液相介质，有时还是反应的产物，水量的变化对整个反应的平衡及宏观动力学影响很大。目前国内外在上述方面的研究的还不够深入。通过对以上几方面理论和实验的进一步深入研究必将对选择合适的助溶剂及用量、水含量和其它反应条件有良好的指导意义，使得低共熔体系酶促反应技术更加成熟，应用越来越广阔。 7 参考文献 [1] Erbeldinger M, Ni X, Halling P J. 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