The Review of the Electrophoresis Chip by MOEMS Jin Qinghui, Chen Jifeng, Zhao Jianlong, Zhen Yangshu, Xu Yuansen (Shanghai Institute of Metallurgy, Chinese Academy of Sciences Shanghai 200050) Abstract This article gives a review on the technology of electrophoresis chip, including the working principles of electrophoresis chip, and its progress, applied fields and perspective. Also it demonstrated the results of our study on electrophoresis chip. Key words Electrophoresis chip, MOEMS, CAE, Microsystem 摘要 电泳芯片技术是近几年发展起来的一种全新的分离分析技术。文章阐述了电泳芯片的工作原理，发展历史及研究现状，应用领域和发展前景等。并介绍了我们在电泳芯片研制方面的一些实验结果。 关键词 电泳芯片 微光机电系统 毛细管阵列电泳 微系统 基于微光机电系统的电泳芯片技术进展 金庆辉 陈继锋 赵建龙 郑养鉥 徐元森** (中国科学院上海冶金研究所 上海 200050) 毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)技术是70年代后期发展起来的一种分离分析技术，具有快速、高效、试剂消耗少等优点，广泛应用于生命科学、生物技术、临床医学、药物学和环境保护等领域。微光机电系统(Micro Opto Electro Mechanical System，MOEMS)技术的发展，为将电泳技术移植到厘米见方的芯片上提供了技术支持。电泳芯片就是利用MOEMS技术在玻璃、硅等基片上刻蚀出预设计好的微管道网络，并在其中进行样品的电泳分离，利用光学或化学方法进行检测。1992年Manz和Harrison等[1]首先提出采用MOEMS技术在平板玻璃上刻蚀微管道，研制小型化、集成化的电泳芯片，最近几年，该项技术已得到迅速发展。与传统毛细管电泳相比，电泳芯片有如下优点：(1)进样方法的改进，使进样量大大减少，节省了昂贵的试剂；(2)由于玻璃基片比毛细管散热能力强，可进一步提高电场强度，达到高效高速分离，提高工作效率；(3)采用MOEMS技术可将反应器、过滤器甚至检测器等集成在一个芯片中，使得进样、反应、分离、检测等过程能在一个芯片中进行，即所谓芯片实验室(lab-on-a-chip)，达到小型化、系统化、集成化的目的；(4)利用MOEMS技术还可在一个基片上制作微管道阵列，可同时对一系列样品进行分离分析，具备并行处理样品的能力。电泳微芯片的出现，受到了人们极大的关注，已成为毛细管电泳研究领域中一个新的生长点。 1 电泳芯片的工作原理及关键技术
图1 A电泳芯片原理图 B 进样过程示意图
如图1A所示为电泳芯片的原理图，一般设计有四个贮液池，S(Sample)为样品池，B(Buffer)为缓冲液池，W1(Waster1)为样品排放池，W2(Waster2)为废液池。进样泳道与分离泳道交叉成“十”字型，交叉处为样品注射口(或进样口)，检测口设在距离W2上1～2cm处。先将筛分介质注入泳道，再在样品池中注入样品，先在S和W1端加上电压，样品便在电场作用下从S端向W1端泳动，完成进样后，在B和W2端加上电压，交叉口处的样品便沿分离泳道泳动，在筛分介质的作用下，样品得到分离，在检测口检出分离结果。进样过程示意如图1B所示。就工作原理而言，电泳芯片与传统毛细管电泳的最大区别是进样方法不同，电泳芯片可以通过改变进样泳道的宽度或交叉口截面的形状，就能够很好地控制进样量，从而达到更好的分离效果。 电泳芯片的关键技术包括芯片的设计和制作，样品进样，高压电泳分离，信号的检测、采集和处理等。 2 电泳芯片技术的发展历史及研究现状
图2 96泳道毛细管阵列电泳芯片,呈辐射状分布,设计进样长度为200 m m,线宽10 m m,最终泳道宽度为110 m m,深度为50 m m,基片直径10cm孔的直径为1.2mm,有效分离长度为33mm。(Anal.Chem.1999.77,p5355) | 图3 用于DNA并行测序的16泳道毛细管阵列电泳芯片,设计进样长度250 m m,线宽10 m m,最终泳道宽度为110 m m,深度为50 m m,基片直径为10cm,厚度1.1mm。样品池和废液池的直径为1.4mm,正极和负极缓冲液池的真径为2.1mm。有效分离长度为70～76mm。(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000,97,p5370)
1992年Manz和Harrison等首先采用微电子机械加工技术在平板玻璃上刻蚀微管道，研制出毛细管电泳微芯片分析装置，成功地实现了荧光标记的氨基酸的分离[1]。这一成果在1993年8月的SCIENCE上发表后[2]，引起了学术界广泛关注，很多研究机构也开始研究该技术。随后有报道利用电泳芯片技术实现了荧光染料[3]、寡核苷酸[4]氨基酸[5,6]、DNA片段[7,8]、PCR产物[7,9]等的有效分离分析。如前所述由于芯片良好的散热性能，在超高电场的条件下不会由于发热而影响筛分介质的性能，有报道能在很短的时间内实现样品的超高速分离[10,11]。近几年来，电泳芯片技术用于DNA测序领域也得到了迅速发展。1994年，Woolley A.T.和Mathies R. A.[12]用自己研制的电泳芯片系统，成功地进行了DNA测序，其设计的泳道截面积为50×8 m m，有效分离长度为3.5cm，DNA样品用四色荧光标记，在540s内读出了150个碱基，准确率达到97%。1998年，Dieter Schmalzing等[13]，将电泳的几个重要参数如筛分介质的成分、进样量、电场强度、有效分离长度等进行优化，对单色标记的DNA样品测序，在200V/cm的电场下，14min内，读出长度为400个碱基，电场为400V/cm时7min内读出长度达350个碱基，分离度均在0.5以上。1999年Shaorong Liu等[14]利用自行研制的芯片系统，实现了高速、高效的DNA测序，在20min内可测出500个碱基长序列，准确率达99.4％。由于分离分析、测序的工作量十分庞大，单泳道的电泳芯片每次只能对一个样品进行分析，不能多样品并行处理。1997年，Woolley A. T.等[15]研制出了多泳道的毛细管阵列电泳芯片(Capillary Array Electrophoresis Chip，CAE chip)，可在160s内对12个不同样品同时进行分析。1998年，Peter C. Simpson和Mathies R.A.[16]研制出了可同时分析96个样品的毛细管阵列电泳芯片，该芯片有96个样品槽，48根分离泳道。1999年，Yining Shi等[17]研制出了96根分离泳道的毛细管阵列电泳芯片，96根泳道呈辐条状分布在直径为10cm的基片上(如图2所示)，可在两分钟内同时分离96个pBR322样品，如图2所示。2000年5月，Shaorong Liu等[18]报道了最新进展，用自行设计制作的16根泳道的毛细管阵列电泳芯片进行了自动DNA测序，从自动加样、进样到测序完成只需18min，每根泳道可测出543个碱基，准确率达99％以上(如图3，4所示)。
图4 利用毛细管阵列电泳芯片系统得到的四色荧光标记DNA测序图谱，可读出543个碱基，准确率达99%以上。(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000,97,p5372)
中科院上海冶金所在该领域的研究也取得了一些进展。我们设计制作了电泳芯片，并根据激光共聚焦原理制作了一套激光诱导荧光检测系统。实验结果表明，该电泳芯片系统能对DNA片段进行很好的分离和检测，检测限已达10－19mol，如图5，图6所示。在国内，清华大学近期研制了一台电泳芯片系统样机，并对FITC-Arg与FITC-OH进行了分离[19]。
图5 电泳芯片系统样机 | 图6 DNA片段分离图谱,第1,2,3,4,5分别为荧光染料、18mers寡核甘酸、91mers、117mers、208mersDNA片段
3 应用与发展前景 电泳芯片技术为分离分析领域提供了一个全新的技术平台，它吸取了传统毛细管电泳技术的优点，还具有分析速度更快、微型化、易于与其它装置集成等独特优点，其应用范围更广。目前主要应用于氨基酸、多肽、蛋白质的分离分析及DNA的分离及测序，PCR扩增产物的检测，基因突变点的检测，药物的筛选、手性分子拆分、药物有效成分的分离等。 目前，电泳芯片研究主要集中在以下几个方面：(1)将微型反应器、微型分离管道等微型器件等集成在一起，在芯片上实现化学反应和样品分离；(2)研究开发多泳道、高通量的并行处理芯片、实现样品的并行处理；(3)在硅片和高分子材料等不同材料的基片上制作电泳芯片，降低成本，扩展新的应用领域；(4)研究电泳芯片新的检测技术，并将检测装置集成到芯片上；(5)研究电泳芯片与其它分析方法的联用，如电泳芯片与质谱的联用，电泳芯片与基因芯片的联用等。 电泳芯片正在从实验室走向市场，如Agilent公司最新推出的Agilent 2100 Bioanalyzer，就是利用该技术开发的产品。电泳微芯片具有十分可观的市场前景，相信在不久的将来，高速高通量的电泳芯片DNA序列分析仪以及其它电泳芯片分析仪也将从实验室走向市场。 4 参考文献 [1] Manz A , Harrison D J, Verpoorte E M J et al. J.Chromatogr. 1992,593：253-258. [2] Harrison D J, Fluri K, Manz A et al. Science 1993,261, 895-897. [3] Jacobson S C, Hergenroder R, Koutny L B et al. Effects of Injection Schenes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem., 1994,66：1107-1113. [4] Effenhauser C S, Paulus A, Manz A et al. Anal. Chem., 1994, 66：2949-2953. [5] Effenhauser C S, Manz A, Widmer H M et al. Anal. Chem., 1993,65：2637-2642. [6] Jacobson S C, Hergenroder R, Moore A W et al. Anal.Chem., 1994,66：4127-4132. [7] Woolley A T, Mathies R A. Proc.Nanl.Acad.Sci.USA 1994, 91：11348-11352. [8] Jacobson S C, Ramsey J M. Anal.Chem. ,1996,68：720-723. [9] Waters L C, Jacobson S C, Kroutchinina N et al. Anal.Chem., 1998,70：5172-5176. [10] Jacobson S C, Hergenroder R, Koutny L B et al. Anal.Chem., 1994,66：1114-1118. [11] Jacobson S C, Culbertson C T, Daler J E et al. Anal. Chem. ,1998, 70：3476-3480. [12] Woolley A T, Mathies R A. Anal.Chem. ,1995,67：3676-3680. [13] Schmalzing D, Adourian A, Koutny L et al. Anal.Chem. ,1998,70：2303-2310. [14] Liu S R, Shi Y N, Mathies R A et al. Anal.Chem. ,1999,71：566-573. [15] Woolley A T, Sensabaugh G F, Mathies R A. Anal.Chem., 1997,69： 2181-2186. [16] Simpson P C, Roach D, Woolley A T et al. Proc,Natl.Acad.Sci. USA ,1998,95：2256-2261. [17] Shi Y N, Simpson P C, Mathies R A et al. Anal.Chem.,1999,71： 5354-5361. [18] Liu S R, Ren H J, Jovaovich S B et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000,97：5369-5374. [19] 金亚，罗国安等. 毛细管电泳进展(第四卷).广州：林炳承 陈义，2000：219-220. 金庆辉 男，28岁，博士研究生，从事生物微芯片系统的研究。 **联系人 上海市科技启明星计划和973项目(G1999033107)。2000-09-12收稿，2000-11-24修回。