Liu Junyi, Cheng Zhijian, Wu Xiaohua
(Department of Bioorganic Chemsity, Beijing Medical University, Beijing 100083)

    5-甲酰四氢叶酸钙(L(±)5-CHO-THF^.Ca)作为甲氨喋呤(MTX)的解救药以及与5-氟尿嘧啶合用广泛用于肿瘤临床化疗。近年来该药也用于巨核红细胞性贫血、牛皮癣和风湿性关节炎的治疗^[1]。
    由于5-甲酰四氢叶酸钙广泛用于临床，所以科学工作者一直在寻找适合于工业及大量制备和纯化的方法，但是到目前为止仍使用传统的制备方法，也就是用硼氢化钠或催化氢化将叶酸(1)还原为四氢叶酸(2)，然后用DMSO和新制备的甲乙酐甲酰化或无水甲酸、甲酸乙酯-DMSO-吡啶，直接酰化等方法^[2]。这些方法对原料叶酸的纯度要求较高，工业上一般是将药用规格的叶酸转化成镁盐，再精制，纯化率较低，损失较大，产品收率也不稳定，以叶酸计算一般在16%以下。反应中所用的其它试剂有的要即时制备，有的要无水，反应条件较苛刻。因此研究合成及纯化5-甲酰基四氢叶酸钙的方法具有重要的应用价值。
    制备5-甲酰四氢叶酸钙的关键步骤是将叶酸还原成四氢叶酸(2)以及阻止四氢叶酸的氧化。而用NaBH₄或催化氢化还原法除了还原剂昂贵和操作不便外，最大的不足是在条件缓和下，还原反应不完全，产生大量二氢叶酸，当条件较剧烈时，分子发生断裂产生蝶呤和对氨基苯甲酰基谷氨酸(PABGA)，使产率降低，分离纯化困难。笔者在参考文献的基础上研究改进了合成及纯化方法，以药用规格的叶酸为原料(不纯化)，用易得的Na₂S₂O₄做还原剂在碱性条件下还原叶酸为四氢叶酸，以惰性气体和加入抗氧化剂来保护产生的四氢叶酸，用98%甲酸和2%三氟乙酸直接N⁵甲酰化，再与CaCl₂作用得5-甲酰四氢叶酸钙(5)。合成路线如下：
1 讨论
    控制5-甲酰四氢叶酸钙(5)的产率及纯度的关键步骤之一是如何将叶酸用合适的还原剂还原成四氢叶酸而不产生分子内断裂及二氢叶酸。笔者试用Na₂S₂O₄作为还原剂是因为它易得、便宜、适用于工业及大量制备四氢叶酸，后处理方便等。发现在室温、碱性条件下，Na₂S₂O₄还原能力较弱，在反应8～10h后仍有较多原料存在，而提高温度到45～55°C时反应进行的很快，只用约1h，叶酸完全转化成四氢叶酸，TLC检测，未发现有喋呤、PABAG及其它的杂质点出现。因此用Na₂S₂O₄还原叶酸比用NaBH₄及Pt₂O-H₂方法成本低，操作容易，后处理方便，产率高。影响5-甲酰四氢叶酸钙收率及纯度的另一个主要原因是四氢叶酸(2)对光及空气敏感，极易氧化。为了保证四氢叶酸在生成后不易被氧化，采用通惰性气体及加入抗氧剂维生素C并快速进行后处理，防止了四氢叶酸在处理过程中被氧化。四氢叶酸分子中最易发生氧化的部位是N^5[3]，而当N⁵上接有拉电子取代基时，稳定性大大提高。因此在得到四氢叶酸湿品后立即与98%甲酸和2%三氟乙酸反应。反应结束后尽可能将HCOOH和CF₃COOH除尽，再加入0.5mol/L HCl室温搅拌过夜使中间产物全部转化成(3)。若在较高温度下搅拌反应可缩短反应时间，但是溶液变黑，后处理困难。将(3)转化成(4)时关键是溶液pH值，在pH5.5～11.6范围内，转化反应都可进行，发现在微酸性时转化反应所需的时间短，产率高。/为3.61-3.94^[3]。进一步纯化也可用柱层析方法，经过两次层析分离，5-甲酰基四氢叶酸的紫外吸收比值/可提高到4.35^[3]。化合物(4)在pH 7.3时加入CaCl₂可直接转成钙盐，分次向钙盐溶液中加入无水乙醇可析出较大颗粒沉淀，总产率在40%～42%。¹H NMR在8.90和8.22的单峰为典型的甲酰基质子两种异构形式^[4]。其余吸收峰与结构相符合。
   
2 实验
    元素分析用P-240分析仪测定，¹H NMR谱用VXR-300S核磁共振仪器，紫外光谱用UV-260光谱仪器。
2.1 5, 10-次甲基四氢叶酸(3)的制备
    10g药用规格叶酸(1)悬浮在70mL水中，加入1mol/L NaOH溶液60mL，搅拌至溶解在通入惰性气体下，加入20g Na₂S₂O₄，保持反应液在45-55°C反应1h，加活性碳脱色，过滤，滤液中加入适量抗氧剂，用2mol/L HCl调至pH 3.5，产生淡黄色沉淀，抽滤，固体用水洗，抽干得四氢叶酸(2)。将化合物(2)转移到烧瓶中，在惰性气体保护下加入98%HCOOH 80ml和2% CF₃COOH 2mL，搅拌至溶解，室温放置过夜后再搅拌反应8h，60°C水浴下减压至糖浆状，加入0.5mol/L HCl 200mL，在40-45°C下减压蒸除残留HCOOH和CF₃COOH。剩余溶液在室温下放置12h，产生沉淀，抽滤，固体用0.01mol/L HCl洗一次，抽干得(3)，干燥(P₂O₅)，7.5g，产率67%，元素分析：C₂₀H₂₂N₇O₆)⁺Cl^- H₂O，计算值/%：C47.11, H 4.74, N 19.23, 实测值/%：C47.20, H 4.63, N 19.20。m.p.>300°C。
2.2 5-甲酰基四氢叶酸钙(5)的制备
    将化合物(3)8g加入150mL沸水中，在惰性气体下搅拌成悬浮液，缓慢加入3.6mol/L NaOH使反应液逐渐澄清至完全溶解，pH上升至6.5，回流反应液12h，其间用1mol/L NaOH溶液调节pH 6.5～6.9，放置过夜，再调pH至7.5。在55°C下加入含3g CaCl₂的水溶液8mL，搅拌反应30min，过滤，滤液加入无水乙醇300mL，冷却，析出淡黄色固体，重复溶解固体及加无水乙醇2次，得产品5-甲酰四氢叶酸钙(5) 5.2g，产率63%，R_f=0.83(磷酸盐缓冲液pH7)，m.p.>300°，元素分析：C₂₀H₂₁N₇O₇ ^.0.5 C₂H₆O ^.1.8H₂O，计算值(%)：C44.49, H 4.91, N 17.29，实测值/%：C44.40, H 4.97, N17.23, 282mm(0.1N NaOH), ¹HNMR(DMSO-d₆)，2.21-2.85(m, 4H, H_{b, g}), 3.20-3.91(m, 3H, H6, H7), 4.71(t, 1H, H_a), 7.05-8.01(2d, 4H, J=8Hz, Ar-), 8.22和8.90(2S, H-CO-N⁵)。
3 参考文献
[1] Brunner H,  Bublak P,  Helget M. Chem. Ber., 1997, 130, 55-61.
[2] Benkovic S J. Acc. Chem. Res., 1978, 11, 314-320.
[3] Flynn E H,  Bond T J,  Bardos T J, et al. J. Am. Chem. Soc., 1951, 73, 1979-1982.
[4] Weber R,  Viscontini M. Helv., 1977, 60, 152-160.

国家教委留学回国启动基金资助项目。2000-03-09收稿。