Wang Xianchun, Liang Songping
(College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081)
Abstract The experiments on
the elution of synthetic peptide from the resin after cleavage and routine trifluoroacetic
acid wash by 4 solvents, namely ethyl acetate, n-butanol, acetonitrile and trifluoroacetic
acid, were made to investigate the possibility of increasing synthetic peptide recovery
rate .The results showed that the efficiency of peptide elution was related to the
polarities of the peptide and solvent. More hydrophilic peptide could be eluted by polarer
solvents efficiently.Its recovery rate could be improved by increasing trifluoroacetic
acid wash times. As regard to the peptide of high hydrophobicity, the less polar solvents
could improve its recovery rate when used as eluents after the trifluoroacetic acid
treatments.
Key words Peptide recovery rate, Elution efficiency, Eluent, Solid-phase
peptide synthesis
摘要 利用4种极性不同的溶剂(醋酸乙酯、正丁醇、乙腈及三氟乙酸)分别对经裂解处理并用三氟乙酸常规性洗涤3次后的残存多肽树脂进行进一步的洗脱实验，探索恰当增加裂解后洗脱剂的种类以增强多肽洗脱效率,提高固相多肽合成收率的可能性。结果表明，洗脱溶剂对多肽的洗脱效果与多肽及溶剂的极性有关：亲水性较强的多肽用极性较强的溶剂洗脱时效果较好，可用增加三氟乙酸的洗脱次数来提高这类多肽的洗脱率；而对于疏水性较强的多肽来说，在三氟乙酸洗脱后换用极性较弱的溶剂进行洗脱更有利于提高合成多肽的总收率。
关键词 多肽收率 洗脱效果 洗脱剂 固相多肽合成
不同溶剂对合成多肽洗脱效果的比较
王贤纯 梁宋平**
(湖南师范大学生命科学学院 长沙 410081)
固相多肽合成技术自60年代由美国的Merrifield R B建立以来，在短短30余年的时间里获得了飞速的发展。自动化固相多肽合成仪的普遍应用标志着该项技术方法学的基本成熟和完善。目前固相多肽化学研究的主要任务是优化条件以进一步提高接肽缩合率和有效脱除保护基及树脂，因为这些都是决定多肽纯度、多肽收率乃至多肽合成成败的关键环节[1]。实际上，要有效地使合成多肽与树脂分离，除了采用正确的裂解策略外，选择适当的溶剂对裂解处理后的多肽进行洗脱也是一个很重要的方面，因为在实验中发现，用固相法合成时多肽的收率并不太高，尤其是合成分子量较大的多肽时，纯品收率平均约30%~40%。其的重要原因之一是经裂解处理后的多肽难以完全洗脱下来，在通常使用的三氟乙酸多次洗脱后，合成柱内往往仍残留有相当一部分多肽，这是因为裂解下来的部分多肽非特异性地吸附到树脂和合成柱内壁上，或重新与树脂连接[2]。因此，根据不同情况选择不同的洗脱溶剂进行洗脱有可能改善洗脱效果，从而提高合成多肽的总收率。
1 材料和方法
1.1 材料
经裂解试剂R裂解并用三氟乙酸洗脱3次后的残存肽树脂共3种: 33肽树脂(223.0mg)、22肽树脂(232.1mg)和14肽树脂(80.0mg)。
各多肽的氨基酸序列如下:
33肽： H2N-YCKGVFDACTPGKNECCPNRVCSDKHKWCKWKL-COOH
22肽： H2N-ACKGVFDACTPGKNECCPNRVC-COOH
14肽： H2N-GQKNDYEAGFLAPL-COOH
三氟乙酸为美国Estaman公司产品;乙腈,正丁醇、醋酸乙脂和乙醚均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
将每种残存多肽树脂用N2吹去三氟乙酸后分别分成4等份,装入4个手工合成柱中。分别加入0.5 mL三氟乙酸、乙腈、正丁醇或醋酸乙酯后用YKH-I型液体快速混合器振荡1.0 min, N2吹滤入相应的离心管中。重复5次。将含多肽的滤液浓缩至1.0 mL以下后加预冷乙醚沉淀多肽;3000r/min离心20 min,收集沉淀并用乙醚重复洗涤2次后冷冻干燥过夜。
各多肽粗品定量后溶于30%乙腈，取可溶部分经RP-HPLC分析以测定各样品中纯品的含量(近似地用RP-HPLC图谱中目的峰面积占总面积的百分比推算)。
2 结果
2.1 33肽的洗脱效果
4种溶剂分别对33肽进行洗脱后所得的多肽粗品及纯品量见图1。
图1 4种溶剂对33肽的洗脱效果
从图1可见,无论按粗品量,还是纯品量比较,三氟乙酸和乙腈的洗脱效果要比醋酸乙脂和正丁醇的好，说明33肽适合于用极性较强的溶剂洗脱，可用增加三氟乙酸洗脱次数的方式提高合成多肽的洗脱收率。
2.2 22肽的洗脱效果
4种溶剂对22肽的洗脱效果见图2。
图2 4种溶剂对22肽的洗脱效果
图2显示，对22肽而言，极性较强的溶剂仍显出较好的洗脱效果；与33肽的洗脱粗品相比，22肽洗脱粗品中的杂质含量要高一些。
2.3 14肽的洗脱效果
分别用4种溶剂洗脱14肽后所得的粗品及纯品量见图3。
图3 4种溶剂对14肽的洗脱效果
从图3可以看出，
就粗品量而言，洗脱效果的好坏依次为：正丁醇、三氟乙酸、醋酸乙酯和乙腈。以14肽纯品比较，则以正丁醇的洗脱效果为最好，醋酸乙酯的次之，三氟乙酸的洗脱效果最差，说明对该14肽而言，在常规性地使用三氟乙酸洗脱后，再增加三氟乙酸的洗脱次数并不能有效地提高多肽洗脱率，因为洗下来的主要是杂质。
3 讨论
固相多肽合成完成并经裂解处理后处于无水的酸性环境，在这样的环境中，处于变性状态的合成多肽与树脂之间存在较强的相互作用而难以完全洗脱下来。由于多肽分子和树脂颗粒表面都有许多极性和非极性基团，所以多肽与树脂间的相互作用实质上主要是这些基团间的相互作用。不同多肽分子中极性和非极性氨基酸残基间的比例及排列顺序不同，使得它们在相同的环境中与树脂间作用有所差异。对含非极性残基较多的多肽而言，与树脂间的作用主要为疏水相互作用；反之，对含极性残基较多的多肽来说，在多肽与树脂的作用中疏水相互作用就小一些，这就给用不同极性溶剂洗脱不同的合成多肽的实践提供了理论依据。本实验中受试的33肽、22肽和14肽各分子中极性残基所占的比例分别为66.7%、59.1%和42.9%。实验结果显示,33肽的极性最强，适合于用极性较强的溶剂洗脱，随着洗脱溶剂极性的减弱，洗脱效果呈下降趋势；22肽也有较强的极性，极性较强的溶剂仍能获得较好的洗脱效果；14肽的极性较弱，用极性较弱的正丁醇洗脱能获得比三氟乙酸好得多的效果。这样，在多肽与洗脱溶剂的极性之间呈现一种大致的平行关系，即极性较强的合成多肽宜用极性较强的溶剂洗脱，可用增加三氟乙酸的洗脱次数来提高合成多肽的洗脱收率；而极性较弱的合成多肽宜用极性较弱的溶剂洗脱，应考虑在常规性地使用三氟乙酸洗脱后换用极性较弱的溶剂接着进行多肽的洗脱。
当然，在讨论多肽与树脂间的作用时，除了考虑多肽的氨基酸组成外，还要考虑多肽链本身可能的卷曲和折叠方式，因为多肽的卷曲折叠会改变分子表面极性和非极性残基的分布比例和溶解性。Chou和Fasman[3]在分析了大量已知二级结构的蛋白质中全部20种基本氨基酸在a-螺旋、b-折叠及无序卷曲三种构象中出现的频率后，计算出了每种氨基酸残基在肽链中趋向形成各种构象的参数值Pa、Pb和PC，发现含非极性残基较多的肽链形成b-折叠结构的可能性就大一些(Pb>>Pa及PC)；反之，含极性残基较多的多肽链形成无序卷曲的可能性最大(PC>>Pb)；Pro和Gly的存在有利于无序卷曲的形成。参照此法分别计算本实验中三种多肽的Pa、Pb和PC值后可知，它们的PC值都大于Pb，而且都含有Pro和Gly，所以推测3种多肽都主要以无序卷曲的构象形式存在。同时，它们的PC值都大于1，根据Narita等人的研究结论[4]，估计它们在各实验溶剂中的溶解性不成问题。这样，对于主要以无序卷曲形式存在且溶解性不成问题的多肽分子来说，氨基酸组成中极性和非极性残基的比例可大致反映溶液中分子“表面”两类残基的分布比例，但不排除残基排列顺序的不同或某些情况下的特殊构象改变这种分布规律。所以，根据多肽的氨基酸组成及Pa、Pb和PC参数值来探讨其与树脂之间相互作用的实质以及选择合成多肽的洗脱溶剂时，也要适当考虑某些其它因素的影响。
4 参考文献
[1] 王德心.固相肽合成中保护-裂解方式的研究进展.化学通报, 1991, 2:1-7.
[2] Atherton E, Sheppard R C. Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. Oxford:
Oxford University Press, 1989: 149-156.
[3] Chou P Y, Fasman G D. Conformational parameters for amino acids in helical,
beta-sheet, and random coil regions calculated from proteins. Biochem , 1974,
13(2):211-222.
[4] Narita M, Ishikawa K, Chen J Y. Predication and improvement of protected peptide
solubility in organic solvents. Int. J. Pept Prot Res.,1984, 24(6): 580-587.
王贤纯 男，41岁，籍贯：教授，博士，从事蛋白质化学与蛋白质工程的研究。
**联系人 国家863高技术发展计划(103-13-01-06)。