Application and Delelopment of Modern Immunoasays in Pesticides Monitoring Wang Fangqiang, Dan Dezhong, He Jun#, Li Yuqi#, Li Yong# (Institute of Environmental Science and Engineering ,Sichuan University, Chengdu 610065 #Institute of Pharmacy,West China University of Medical Science, Chengdu 610041) Abstract The application and development,as well as its prospect of the novel technique modern immunoassays in pesticides monitoring was reviewed in this paper. Key words Immunoassay, Environmental monitoring, Pesticides 摘要 本文着重介绍了现代免疫分析这种新颖的技术在农药监测中的应用、 进展及其广泛的应用前景。 关键词 免疫分析 环境监测 农药 现代免疫分析在农药监测中的应用及进展 王方强 但德忠** 何俊# 李毓琦# 李勇# (四川大学环境科学与工程学院 成都 610065 #华西医科大学药学院 成都 610041） 本世纪50年代以来，世界各国开发了大量的有机磷农药，目前在农业上应用的就有100多种，其在水、土壤和食物中的残留量不断上升，对环境和人类健康形成了潜在的威胁，各国对这一现象日益关注。1985年，欧共体(EEC)颁布的饮用水标准规定任何一种农药最大的允许浓度为0.1 m g/L[1]。美国等针对杀虫剂颁布了新的法规。我国亦将对硫磷、除草醚、敌百虫等农药列为环境优先监测污染物。多年来，高效液相色谱(HLPC)或气相色谱与质谱联用(GC/MS)承担着环境中农药残留的常规检测任务，然而，它们需要复杂的前处理、昂贵的仪器设备、熟练的技术人员，完成一次分析费时和费用高，已难以满足环境监测中大量样品的快速检测需要。因此人们迫切需要一种简单、快速及价廉的检测技术。环境监测中农药免疫分析的出现就是这种需求努力的结果。 免疫分析是以抗原与抗体的特异性结合为基础，其原理是利用生物分子识别，灵敏度高，特异性强，故在临床医学上有极其重要的地位。80年代初，Hammock和Mummas首先将免疫分析用于农药残留分析[2]。农药免疫分析法不但具有与常规分析法相当或更高的灵敏度，而且无须使用昂贵仪器设备，方法简便快速，在农药残留的快速筛选和定量检测以及现场和快速检测方面已显示独特的优点，受到环境监测工作者的重视。尽管免疫分析用于农药残留检测只有10多年时间，但发展很快。目前已建立了约50种农药及降解产物的免疫测定法(表1)[3]。然而，这一新颖技术在环境监测中的应用目前还不为国人熟悉。本文拟对现代免疫分析及其在农药监测中的应用进行评述。
表1 农药监测中的免疫分析
农药名称 | 基体性质 | 测定方法 | 检出限
2,4-D和2,4,5-T | 水 | RIA* | 0.1ng
除虫脲 | 水 | EIA* | 1～40ng/mL
| 牛奶 | EIA | 2ng/mL
甲草胺 | 水 | EIA | 0.2～8ng/mL
硫丹 | 水 | EIA | 3ng/mL
氟哒酮 | 水 | EIA | 1ng/mL
禾草特 | 水 | EIA | 15ng/mL
莠去津 | 水 | EIA | 10ng/mL
| 土壤 | EIA | 20ng/g
| 食品 | EIA | 0.5ng/mL
| 水 | EIA | 0.03ng/mL
百草枯 | 空气 | EIA | 0.1～1ng/mL
杀虫脒 | 大米 | EIA | 0.5ng/g
真菌毒素 | 牛奶 | RIA | 0.1ng/mL
Alachlor | 水 | ELISA* | 1×10-9
Aldicarb | 柑橘汁 | ELISA | 7.5×10-5
| 水 |  | 3×10-5
Bentazon | 水 | ELISA | 2×10-9
Benomyl | 食物 | ELISA | 3.5×10-5
苯、甲苯和二甲苯 | 水 | ELISA | 5×10-6
2,3,7,8-TCCD | 沙土 | RIA | 0.7pmol
PCCDs and PCDFs | 土壤 | ELISA | 1×10-9
多氯联苯 | 土壤 | ELISA | 5.0×10-5
| 水 | RIA | 2.0～8.0×10-8
T-2 毒素 | 大麦 | ELISA | 1×10-10
Iazethapyr | 土壤 | FIA* | 0.3ng/mL
注： RIA—放射免疫法；ELISA—酶联免疫吸附法；EIA—酶免疫分析法；FIA—荧光免疫分析法；
1 放射免疫分析(RIA) 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。它包括以标记抗原(Antigen, Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody, Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay ,IRMA)。前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。 最早建立的农药免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D和2,4，5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。1982年后发表的农药免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。 2 酶免疫法(EIA) 酶免疫法(Enzyme Immunoassay, EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。 EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、酶免疫试验法(Enzyme-monitored Immunotest , EMIT)、竞争结合酶免疫分析法(Competitive Binding Enzyme Immunosorbent Assay, EIA)和免疫酶分析法(Immunoenzymometric Assay, IEMA)。其中基于竞争吸附的ELISA已成为农药监测中的首选方法。 美国环境保护机构(USEPA)开发了野外便携式和实验室ELISA方法，其主要目标是建立便于野外监测危险污染物的简便方法。监测的靶分析物包括多氯联苯、苯、甲苯和二甲苯混合物、硝基芳烃化合物、对硫磷、carbaryl和其它杀虫剂。美国食品药物管理局(USFDA)主要将ELISA集中于食品和饲料中农药残留的检测，开发了天然霉素(黄曲霉素)的免疫分析，目前正在研究用于检测phenamaphos和carbendazine 等化合物的检测方法。美国农业食品安全检查部门(USFSIS)资助开发了除草菊酯、有机氯杀虫剂及其它化合物的免疫分析法，并采用现有的方法来完成其监测任务。 图1 野外便携式ELISA试验盒的检测程序 近年来，Immunosystems Inc.已生产出了几种ELISA试剂盒，其靶分析物包括杀虫剂、杀菌剂和除草剂。这种试剂盒配上便携式分光光度计可实现野外定量快速测定，检测灵敏度为0.03～25ppb。便携式ELISA试剂盒检测程序见图1。 随着ELISA在农药监测中的应用范围的不断扩大，一些新方法也不断涌现。Hall等用EIA法检测了水样中的污染物2,4-D,三嗪，Merolachlor并将其与气相色谱分析结果进行比较。Roda[4]等利用EIA对环境水样中苯并芘进行了测定。 Hong利用ELISA对土壤和水中三氮杂苯类除草剂进行了测定。Hutchinson等利用ELISA检测土壤中的EPTC。Wittmann用酶免疫分析法检测残留在食品中的三嗪。Weller[5]通过改变温育时间，提高了ELISA检测三氮杂苯类除草剂的灵敏度。我国的研究者也自行开发了一些ELISA法。刘长武 [6]应用ELISA对梨、苹果中的对硫磷残留进行了测定。余万俊 [7]制备了杀虫脒的特异性抗体，并以此抗体建立了大米中杀虫脒残留的单克隆抗体ELISA检测法。阳传和[8]应用B淋巴细胞杂交瘤技术，研究出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体，并建立了小麦T-2毒素的ELISA方法。周永新等[9]进行了蓖麻毒素多克隆抗体的研究。 ELISA的快速发展，主要是由于其高度的重现性、灵敏度和较短的分析时间所决定的。许多环境化合物的特异性单克隆和多克隆抗体的制备及应用为ELISA的快速发展奠定了基础。 3 荧光免疫分析(FIA) 本世纪40年代，Coons采用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原，首次创建了荧光抗体检测技术。荧光免疫法具有专一性强、灵敏度高、标记物不易失活、价格低廉、无放射性污染等优点。至今，FIA已广泛应用于微量、超微量物质分析测定。FIA常用的荧光素有异硫氰酸酯(Fluoresceine isothiocyanate , FITC)和罗丹明(BLissamine Rhodamine B200, RB200)等。将荧光免疫与光纤传感器结合形成的荧光免疫传感器是近年来荧光免疫法研究十分活跃的领域。荧光免疫传感器是将抗体(抗原)固定在适当基底上，实现生化荧光信号向光电信号的转变，以对待测物质进行定量检测。测定环境中农药残留的分子识别元件可以是AchE[10]抗体[11]和碱性磷酸酶等。 Rogers等[12]将FITC标记的AchE固定在石英纤维上以检测酶的活性。乙酰胆碱水解时产生的H+猝灭纤维表面的荧光信号，荧光强度减弱。有机磷农药抑制AchE的活性，从而降低荧光猝灭能力，可检测溶液中10-8mol.L-1的AChE抑制剂，其响应时间小于1min。Anis等将有机农药对硫磷抗体和FITC标记的Anti-IgG Ab蛋白固定在石英纤维上制得荧光免疫传感器。测定对硫磷的检测限为10-9mol.L-1。Schulman利用竞争性荧光能量转移法原理，用FITC标记的多克隆氯乙异丙嗪(atrazine)抗体，用四甲基罗丹明标记农药氯乙异丙嗪，研制出光纤免疫传感器，通过增加能量转移的量改善了灵敏度。Northrup[13]利用光纤免疫传感器检测农药中拟除虫菊酯(pyrethroide)。Bier等[14]以荧光和损耗波作用为基础，研究了光纤传感器对三嗪衍生物terbutryn的灵敏度和再生性，检测限0.1ng/mL，可稳定使用8周以上并可循环测定500次。Robert等[15]应用损耗波光纤为基础的免疫传感器还可直接检测地面水中ng/mL水平的蓖麻毒素。这类传感器有很高的特异性，然而对分子量小的有机磷农药，特别是有机磷神经性毒剂，较难诱导出高质量的抗体，加之生物材料在固定化过程中的可能失活等原因使其应用尚不及EIA普遍。目前国内尚无此类工作报道。 荧光免疫分析中的其它发展还有时间分辨荧光多组份免疫分析法的建立及时间分辨荧光免疫分析中荧光效应的研究。 4 免疫传感器 免疫传感器或免疫探针主要是利用抗原或抗体作为识别元件，它可以对分析物连续、有选择性地进行检测。由于吸附常数较大，免疫传感器的主要缺陷是抗原抗体反应不具有良好的可逆性。最近有人利用催化抗体免疫传感技术克服了这个困难，因为催化抗体不仅起着结合作用，同时也从化学角度改变标记分子。 除了前述的光纤免疫传感器外，依据信号转换技术的不同，免疫传感器还可分为：压电免疫传感器、电化学免疫传感器、表面等离子免疫传感器等。 4.1 压电免疫传感器 压电免疫传感器的主要材料为石英，可用来直接检测抗原抗体反应。这种传感器已用于环境中阿特拉津[16]、2,4-D[17]、对硫磷等农药监测中。 4.2 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是由抗原或抗体等分子识别元件和电化学电极组合而成，可以直接检测免疫试剂的结合反应。依据测定的方式的不同可分为：(1)电位免疫传感器 主要测量电极表面固定抗原或抗体与其相应的抗体或抗原结合引起的电极表面电位变化，固定抗体的测量电极与参比电极间的电势差大小与相应自由抗原浓度有关。电位免疫传感器已用于环境中2，4-D除草剂的检测[18]。(2)电流免疫传感器 主要测量电极表面电活性物质被氧化或还原所产生的与其浓度大小成线性关系的电流，一般有氧化酶的参与。Schram等利用双抗电流免疫传感系统对progestarone进行了测定。(3)电容免疫传感器 主要测量电极板上抗原抗体反应所引起的电容变化，电容大小与电容极板表面的介电层(固定抗原或抗体)的厚度和介电性能有关。Bresler等[19]利用ELISA将此类传感技术应用于葡萄糖的测定。(4)电导免疫传感器 这类传感器与电容免疫传感器相似，主要通过测定电流变化从而测出两电极间传感层的电导变化。Sanderg等[20]利用这类传感器对环境中阿特拉津进行了测定。 4.3 表面等离子体共振免疫传感器 表面等离子体是某一波长的光以一定角度照射到金属导体(通常为银或金)表面时所产生的一个瞬息电磁场区。当照射光的角度发生变化时，在某一角度反射光处于最弱，此刻能明显观察到表面等离子现象。这一入射角度与金属表面覆盖介质(固定抗原或抗体)介电常数有关，因而金属表面的固定抗原或抗体发生免疫反应时将影响这一角度变化。Minunni和Mascini[21] 利用表面等离子体共振免疫传感器对环境中农药阿特拉津进行了测定。 5 免疫亲和色谱法(IAC) 免疫亲和色谱法(Immunoaffinity Chromatography, IAC)主要是利用抗原抗体反应有选择性从复杂环境基体中提取待测物，将抗体共价键合到不溶性的固态聚合物上，填充到色谱柱中，由于抗体抗原的可逆性结合，后者被持留，通过改变pH值、离子强度或离液序列高的试剂(Chaotropic agents)及有机溶剂释放出抗原。其原理见图2： 图2 免疫亲和色谱法的主要分离步骤 1.抗体基体的制备 抗体与载体连接;2.抗原与抗体的结合 冲洗掉干扰分子;3.抗原的洗脱 10年前，有人便提出将免疫亲和色谱法用于环境样品中农药的检测[22]，采用特殊抗体从浸渍玻璃纤维过滤器中提取百草枯，实验发现，就环境中Phanylurea 和三嗪富集而言，免疫亲和法优于高效液相色谱(HPLC)。IAC在理论上虽然简单，但在实际运用中还有一些困难，主要是洗脱下来的待测物常常不能产生尖响应峰。为了克服这种情况，有人将高效液相色谱柱或气相色谱连用于IAC。在农药监测中，这种方法已被用于Carbofuran和三嗪[23]的浓缩和分离。 6 流动注射免疫法(FIIA) 随着免疫分析自动化的发展，国外不少研究人员将流动注射分析引入免疫分析中，以此建立的流动注射免疫分析法(Flow Injection Immunoassay, FIIA)具有快速、精确、灵敏度高、易自动化的优势。Gübitz对此有较全面的评述[24]。 目前，均相FIIA和非均相FIIA均有报道。均相FIIA不需进行分离。非均相FIIA仍需用固相载体，并要分离结合的与游离的标记物，但此法灵敏、干扰少，且能提供快速动力学过程。样品在FIIA免疫反应器的短暂停留期间，抗原抗体能快速定量结合。因此目前研究和应用的主要是非均相FIIA。在流动注射酶免疫法和流动注射荧光免疫法中，后者灵敏度更高，似乎更受青睐。Gascon 等[25]建立了高灵敏的流动酶联免疫吸附法测定环境水样中的阿特拉津，检测限达75ng.L-1。Karmer等将特定抗体固定在膜上，试剂由时间控制的泵输入，透过膜的溶液进行酶产物的荧光测定，该法已用于环境水样中农药残留的自动监测。在FIIA中，采用的固相载体有活性膜、毛细柱或其它高比表面基质。其缺点是每次分析后，膜需要换，柱需再生。尽管有报道称有的固相可再生600次，但重复再生过程中最终将失去活性。正因如此，FIIA较普通流动注射分析速度慢。 为了解决这一问题，有人提出采用一种特殊载体—— 磁性微球(Magnetic Particles)来替代一般免疫分析中的活性膜或柱，称为免疫磁珠(Immunomagnetic Beads)。这种免疫磁珠是一种人工合成的含金属核心、并具有高比表面活性基团的高分子微粒(f>2.8mm)，可结合活性蛋白质又可被磁铁所吸引，活性蛋白物质(抗原或抗体等)共价结合于其表面，当与样品接触时，抗原与对应抗体结合，竞争抗原上具有荧光标记物，免疫磁珠通过流动注射流路中反应管外特设的可控电磁场被截留，达到自动分离与受检的目的，作为一种特殊载体，磁性微球具有广泛研究、应用价值，在分离细胞和纯化细胞、免疫检测等方面均显示出良好前景。Lawruk等[26]用磁性微球酶联免疫吸附法测定环境水样及土壤中氰基丫嗪。他同时选用免疫磁珠作为2，4-D抗体固相，检测环境水样中的2，4-D及其酯类。该法灵敏度更高，检出限可达0.7ug/L。 7 环境免疫分析展望 由于免疫分析固有的优点，它在农药残留及其它环境污染物如多联苯、二噁英、天然真菌毒素、抗菌素、添加剂等快速筛选和定量检测方面发挥着重要作用。这种新颖技术不再停留在研究阶段，其中部分技术已商品化，为在环境监测中应用创造了条件，并使之可能成为常规分析方法。从已建立的环境免疫分析法与GC/MC、Soxhlet等常规法的结果比较来看，相关系数多在0.9以上，且免疫分析价格上要便宜的多。据文献[3]比较，GC分析一个样，实验室需要50美元，野外需130～200美元，每天只能分析10个样，而ELISA分析一个样，实验室仅需5～6美元，每天可分析40个样，且每个样稀释三个浓度，每个浓度包括4份平行样。可见环境免疫分析在特异性、灵敏度、费用等方面均体现出较大的优势。 最近我们将荧光免疫分析、光纤传感器、流动技术、免疫磁珠分离四项先进技术联用，已研制成功性能优良的荧光光纤流通池、光纤传感器及其固定架，完成了分析系统的调试，建立起一种新型荧光光纤免疫磁珠流动分析系统。本系统可在流路中完成抗体(抗原)结合态和游离态标记物的自动在线分离，避免了一般流动免疫分析中柱的再生和膜的更换。本分析系统具有通用性，适合于不同的免疫分析体系[27,28]。尽管此系统尚未商品化，但可以预计在环保及相关领域会有广泛的应用前景。 免疫分析在环境中的应用不仅仅局限于农药残留的监测，也成为环境中基因工程微生物(Genetically Engineered Microorganism,GEM)的一种很好的监测手段。近年来，为了治理环境污染，人为引入了许多GEM，研究GEM在环境中的存活、扩散、基因传播及其可能对生态环境和人类健康造成的危害首先必须解决GEM的监测问题。免疫分析对环境中特异GEM的检测效果较佳，已采用的技术有ELISA、免疫荧光直接记数法、免疫磁捕获法等。 抗体的制备是免疫分析的关键步骤，多克隆抗体制备方法简单，费用低，是目前环境免疫中采用最多的方法。然而单克隆抗体亲和力较强、特异性高、杂交瘤细胞株一经建立，抗体的供应源源不断，但其制备所需人才和费用远高于制备多克隆抗体。近年来，单克隆抗体在环境监测中的应用逐渐增多。值得一提的是，基因工程中的DNA重组技术已在许多方面影响免疫分析的发展。目前，抗体重组的研制仍然花费大、耗时且风险大。然而一旦这种技术建立后，其花费比研制单克隆抗体少得多，或许与多克隆抗体的低费用相当。DNA重组技术可能只是一种补充手段，尚不会取代免疫分析中的多克隆抗体技术。这种技术采用抗原选择与基因连接的结合分子，从而不需培育动物便可获得结合分子。利用计算机模拟预测抗体结构，我们或许能改善抗体本身的亲和力和选择性。 免疫分析操作简便，是解决与环境污染有关的许多问题的有效技术。能快速报出结果的野外便携仪有助于确定污染源及污染程度、了解污染物的迁移转化规律以及治理的效果。实验室方法能承担大批量样品分析，并可用于大剂量辐照或流行病学的研究。随着环境问题的日益严峻，人们对环境质量的日益关注，可以预见，免疫分析必将不断发展和进一步完善，并与其它技术有机结合，在环境农药监测中发挥愈来愈大的作用，其前景十分诱人。 8 参考文献 [1] EEC. 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