The study of change and its mechanism of solubility of PHB in chloroform which pretreated over 120°C Qin Jie, Zhange, Peng, Ouyang Fan (State Key Lab. of Biochemical Engineering Institute of Chemical Metallurgy Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100080) Abstract The insolubility of PHB in chloroform which pretreated at over 120°C and its mechanism were studied in this paper. It showed that the solubility of PHB in chloroform will be changed after it was pretreated at the range of 121°C～180°C in 760mmHg vacuum. The grade of insolubility in chloroform of PHB is related with the temperature, time of pretreating and molecular weight. the higher the temperature is the more difficultly it solved, the longer pretreating takes the more difficultly it solved, and the larger the molecular weight is the more difficultly it solved. But heated at 190°C (over its melt point), it convert to soluble in chloroform again. By the characteristic of PHB which heated at 150°C can solved in pyridine and anddimethyl sulfoxide, and the study of NMR, X－crystal diffraction of PHB, it can be concluded that the pretreating at 150°C did not result in the change of primary structure of PHB, and the insolubility of PHB in chloroform related with the change of crystal structure. Key words chloroform, solubility, PHB, crystal 摘要 对 PHB 加热后在三氯甲烷中的溶解性变化及机理进行了研究，PHB在 121°C～180°C真空加热一定时间后，会改变其在三氯甲烷中的溶解性，溶解程度与温度、加热时间、分子量有关。而溶解性的变化并不是因为 PHB 一级结构改变，而是由于 PHB 结晶形态的变化。 关键词 三氯甲烷 溶解性 PHB 结晶度 PHB 加热后在三氯甲烷中溶解性的变化及其机理 秦 杰 张 鹏 欧阳藩 (中科院化工冶金所生化工程国家重点实验室 100080) PHB 是由微生物合成的积累在细胞内的能被环境降解为小分子的高分子材料，是解决“白色污染”的根本途径之一，也因其所具有的压电性和生物相容性而在医学上有着特殊的用途。它的理化性质早在 1973 年 Dawes 等就有过较全面的报道[1]。PHB 熔程为 160～172°C、最高 188°C、最低 157°C，特性粘度为 1.23～1.25g/cm，溶解在：氯仿、三氯乙烯、二氯乙酸、三氟乙醇、二甲基甲酰胺、乙基乙酰乙酸、三油酸甘油酯、冰乙酸，部分溶解于：二氧六环、吡啶、甲苯、辛醇。不溶于：水、丙酮、乙醇、己烷等。其中三氯甲烷是PHB提取、分子量测定中最常用的溶剂，然而,本文的研究表明PHB在 120°C以上加热后在三氯甲烷中的溶解性有很大的变化，虽然 Skrbic.Z(1996)等[2]研究了 30°C～160°C升温过程中PHB的晶胞参数 a 会升高，但当温度降低时晶胞参数 a 也会相应降低到接近原始值。同时对于 PHB 在 120°C以上加热后在三氯甲烷中的溶解性的变化及原因文献中还未见报道。为进一步阐明 PHB 在三氯甲烷中的溶解性与加热温度的关系及其机理，本文对其进行了研究。以进一步阐明PHB的理化特性。 1 材料与方法 菌种：转基因欧文氏工程菌(中国农业大学)[3] 提取：干细胞粉碎后，每 1.5g 细胞加 100ml 三氯甲烷，60～65°C回流 4h，减压蒸馏，蒸出原三氯甲烷体积 1/2-2/3, 加入三倍体积的冷己烷，搅匀静置半小时，抽滤、干燥得 PHB[4]。 样品纯化：由以上方法得到的 PHB 经四次三氯甲烷溶解冷己烷沉淀的重结晶过程获得本实验使用的纯样品，并以 Sigma 公司的 PHB 纯品作为对照用浓硫酸降解法和核磁共振判定其纯度。 分析方法：PHB 含量的测定──浓硫酸降解法[5,6]。 PHB 分子量的测定——粘度法，测定 PHB 氯仿溶液的特性粘度，由特性粘度和粘均分子量的关系，即 Mardk-Houwink 方程，特性粘度的数值仅由试样的分子量M决定：[h] = KMa，K 和 a 是与分子量无关的常数。因而由特性粘度可以确定PHB的分子量 M[7]。 X-射线晶体衍射──采用 Siemens D500 衍射仪，Fe(Kα)线。 2 结果与讨论 2.1 PHB 热处理后在三氯甲烷中的溶解性变化的发现 称取 0.05gPHB 分别在 60、85、100、121°C加热 45min 后加入 20ml 三氯甲烷 60°C过夜, 发现 121°C加热过的 PHB 不能全部溶解于三氯甲烷中。见下图：
| 图1 PHB 在不同温度下加热后在三氯甲烷中的溶解性变化
2.2 加热处理温度和时间对 PHB 在三氯甲烷中的溶解性影响 为了研究 PHB 在三氯甲烷中的溶解性与 PHB 的分子量、前处理温度、时间的关系，纯的 PHB 样品 A(四次重结晶样品纯度>99%)在不同温度、真空度为 760mm 汞柱下加热，隔一定时间取样，室温下冷却，取出 0.05g 加入 20ml 三氯甲烷 60°C溶解 12h 后，过滤、干燥，称不溶部分的重量。计算不溶解部分占加入量的百分率(percentage of insoluble part)。
| 图2 PHB 样品 A 在不同温度下加热时间与不溶解性的关系
由上图 2 可以看出前处理温度越高，处理后 PHB 在三氯甲烷中的溶解度越低；相同温度下前处理时间越长，处理后 PHB 在三氯甲烷中的溶解度越低。前处理温度低于 110°C时即使处理时间延长到 4h，也不会出现不溶现象。 2.3 不同分子量的 PHB 热处理后在三氯甲烷中的溶解性差异 从以上实验可知 PHB 不溶于三氯甲烷的性质不仅与加热温度和时间有关，而且与 PHB 的分子量也有关。为了进一步说明这种不溶解性与分子量的关系。选取分子量不同的 6 种纯的 PHB 样品、在 150°C、真空度为 760mm 汞柱加热 40min，每隔 10min 取样，室温下冷却，取出 0.0500g 加入 20ml 三氯甲烷 60°C 溶解 12h 后，过滤、干燥，称不溶部分的重量，计算不溶解部分占加入量的百分率。
表1 分子量不同的样品经不同时间加热处理后三氯甲烷中
Sample number | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6
intrinsic viscosity | 1.1856 | 0.99842 | 0.94374 | 0.42795 | 0.08882 | 0.01511
10min | 51.4% | 4.4% | 0.8% | S | S | S
20min | 98.4% | 5.2% | 1.8% | 3.8% | S | S
30min | 100% | 92.2% | 92.2% | 92.0% | S | S
40min | 99.2% | 90.0% | 95.0% | 93.8% | S | S
*s 代表全部溶解。
从上表 2 可知，特性粘度较高的 PHB，加热处理后比特性粘度较低的 PHB 难溶于三氯甲烷中，分子量越大难溶的程度越高。 2.4 加热熔融后 PHB 在三氯甲烷中的溶解性 分别取 0.05 克 150°C、真空度为 760mm 汞柱加热 50 分钟不溶于三氯甲烷的 PHB(纯度>99%, 重均分子量为 90.7 万)进一步升高温度到 180°C、190°C、200°C，真空度为 760mm 汞柱 20min 后室温下冷却，加入 20ml 三氯甲烷 60°C溶解 12h 后，过滤、干燥，称不溶部分的重量测定溶解性结果如下
表3 熔融冷却后PHB在三氯甲烷中的溶解性
| 180°C | 190°C | 200°C
state | Not melted | melted | melted
percentage of insoluble part | 98% | 0 | 0
从上表可以看出加热到 190°C以上, PHB 经熔融、室温冷却后又是可以溶于三氯甲烷中的。为了排除 190°C加热引起 PHB 分解对研究的影响，将 190°C 20min 真空熔融、室温冷却的PHB后再经真空 150°C加热 50min，发现其又不溶于三氯甲烷。说明这种不溶于现象是一种可逆现象。 2.5 不溶解性的机理研究 因为 PHB 属于高聚物，高聚物的溶解过程要经过两个阶段，先是溶剂分子渗入高聚物内部，使高聚物体积膨胀，称为“溶胀”，然后才是高分子均匀分散在溶剂中，形成完全溶解的分子分散的均相体系。因而高分子的溶解与其形状(线性、支化和交联状)和聚集态(非晶态与晶态)是密切相关的。首先，对于交联的高聚物，在与溶剂接触时也会发生溶胀，但因有交联的化学键束缚，不能再进一步使交联的分子拆散，只能停留在溶胀阶段，不会溶解。其次，非晶态高聚物的分子堆砌比较松散，分子问的相互作用较弱，因此溶剂分子比较容易渗入高聚物内部使之溶胀和溶解。而晶态高聚物由于分子排列规整，堆砌紧密，分子问相互作用力很强，以致溶剂分子渗入高聚物内部非常困难，因此晶态高聚物的溶解比非品态高聚物溶解困难得多。另外，溶解度还与高聚物的分子量有关，分子量大的溶解度小，分子量小的溶解度大。 因此 PHB 的不溶可能有两方面的原因，一是 PHB 的联状分子发生支化或交联，二是加热使 PHB 的结晶度增高从而导致分子堆砌紧密使溶剂分子难以渗入[7]。 为了阐明 PHB 加热不溶的的机理，首先对加热前后的 PHB 结构用核磁共振进行了结构鉴定：
图3 加热之后的 PHB 的 NMR 氢谱图 |  | 图4 加热之后 PHB 的 NMR 氢谱图
| 图5 PHB的一级结构

由上图3、4可以看出加热前后从核磁共振图谱上看不出PHB在结构上的变化。核磁共振图谱完全与PHB的一级结构相吻合(图5)。
而判定PHB没有交联的关键是能否找到一种溶剂使加热后的PHB溶解，设想如果PHB加热时发生的是交联，溶剂只能使其发生溶涨而不会溶解，所以根据PHB的溶解性和溶剂的溶度参数d以及溶剂的极性分数P选择九种溶剂，称取0.05g经150°C加热50min的PHB。分别加上述溶剂20ml, 温度从室温升到溶剂的沸点，观测PHB的溶解情况:

表4 热处理后的 PHB 在不同溶剂中的溶解性
solvent | boiling point (°C) | solubility parameter d | polarity fraction P | solubility
butyl acetate | 126.5 | 8.55 | 0.167 | not
acetic ether | 77.1 | 9.1 | 0.167 | not
chloroform | 61.7 | 9.3 | 0.017 | not
cyclohexanone | 155.8 | 9.9 | 0.380 | not
dioxane | 101.3 | 10.0 | 0.006 | not
pyridine | 115.3 | 10.7 | 0.174 | Soluble(100°C)
dimethylfomamide | 153.0 | 12.1 | 0.772 | not
glacial acetic acid | 117.9 | 12.6 | 0.296 | not
dimethyl sulfoxide | 189.0 | 13.4 | 0.813 | Soluble(120°C)

表4的结果是 20ml 吡啶和二甲基亚砜分别在 100°C和 120°C时可以完全溶解 0.05g 经 150°C、50min 加热过的 PHB，因此可以排除 PHB 加热后发生交联的可能。
因此，加热使 PHB 不溶于三氯甲烷的原因就很可能与 PHB 结晶有关。进一步将从菌体中提取出来的原始纯的 PHB，150°C加热 50min 后经室温冷却的 PHB 和 150°C处理过的样品再经 190°C加热 5min 熔融后经室温冷却的 PHB，用X光晶体衍射研究其结晶度和结晶形式的变化情况。

图 6 三氯甲烷提出的原始 PHB 的 X 光晶体衍射图 图 7 150°C加热后的 PHB 的 X 光晶体衍身图

| 图

8 190°C加热后的 PHB 的 X 光晶体衍射图

由图 6 与 7 叠加比较可知 150°C加热后总得结晶峰的强度并没有明显提高，而是使图 6 中①的位置一个宽大的峰分化成了②③④明显三个峰，同时在 2 q=32(q 为布拉格角)到 2 q=38 度之间分化出了一些小峰。由图 6、7 与 8 叠加比较看出，190°C加热后，峰的强度都有较大的下降，最强的峰由原来的 150CPS(光量子数/秒)左右降到了 90CPS 左右，其他各峰也有相应降低，所以熔融后结晶度有明显下降，同时峰的形状又恢复到了加热之前的样子，②③④三个峰又重新合并成一个大峰，2 q=32 到 2 q=38 度之间的小峰也变得不明显了。
以上结果与 PHB 的 150°C加热 50min 后不溶于三氯甲烷，而再经 190°C加热熔融后又可以溶于三氯甲烷的现象综合考虑。说明 PHB 加热后不溶于三氯甲烷的原因并不是因为加热后结晶度的提高，而是因为加热后使 PHB 的结晶形态发生了改变。在加热的过程中结晶形态发生了转变，出现了新的结晶形态，这种新形态的 PHB 结晶堆砌更加紧密、不同的 PHB 分子链的参与更多，因而即使在三氯甲烷的沸点温度下也难以使其溶解，而结晶的具体形态还有待于进一步的研究。
4 结论
(1)PHB 在 121°C～180°C真空加热处理后会改变其在三氯甲烷等有机溶剂中的溶解性；相同温度下加热时间越长越不易溶解于三氯甲烷；加热时间一定时温度越高越不易溶解于三氯甲烷；温度、时间都一定时分子量越高越处理后不易溶解。
(2)PHB 在低于 110°C时即使加热到 4h 后仍可完全溶于三氯甲烷中，在 121°C～180°C加热后不能溶解的PHB再将其加热熔融后又可使其完全溶于三氯甲烷中。
(3)PHB 在 121°C～180°C真空加热后部分或全部不溶于三氯甲烷的性质，并不是因为加热使 PHB 一级结构发生改变(如交联等)，也不是因为结晶度的增减，而是因为加热使 PHB 结晶形态发生了改变。
5 参考文献
[1] Dawes E A and Senior P J. The Role and regulation of Energy Reserve Polymers in Micor-organisms in Advances in Microbial Physiology (Vol.10), London and NewYork: Academic Press, 1973: pp203-255
[2] Skrbic Z and Divjakovic V. Polymer communications. Polymer, 1996,37(3):505-507
[3] 田杰生. 真养产碱杆菌聚-b-羟基丁酸合成酶基因在欧文氏菌中的表达, 北京农业大学硕士论文，1992: 1-25
[4] 盛青等. “八五”国家重点科技攻关项目技术资料-5, 1995
[5] Ward A C and Dawes E A. A disk assay for poly-b-phdroxybutyrate, Anal. Biochem, 1973, 52: 607-613
[6] Williomson D H and Wilkinson J F. The isolation and estimation of the poly-b-hydroxybutyrate inclusions of Basillus species. J. Gen. Microbial, 1958, 19: 198-209
[7] 何曼君等. 高分子物理,复旦大学出版社，1990:152-186

秦杰 男，35 岁，辽宁省辽阳市人，助研，博士生，从事生物可降解塑料研究。
国家863计划资助项目(715-004-0200) 99-07-14 收稿, 99-08-17 修回。