The Progress in Enzymatic Synthesis of Fatty Acid Polyalcohol Esters Xia Yongmei, Zhang Kechang, Fang Yun (Wuxi University of Light Industry, Wuxi 214036) Abstract The progress in enzymatic synthesis of fatty acid polyalcohol esters was introduced especially in which of monoglycerides and sugar esters. Key words Enzyme, Synthesis, Surfactant, Polyalcohol, Ester 摘要 介绍了酶法合成脂肪酸多元醇类非离子表面活性剂在近10年内的最新进展。着重叙述了脂肪酸单甘油酯和脂肪酸糖(醇)酯的酶促合成。 关键词 酶 合成 表面活性剂 多元醇酯 酶法合成脂肪酸多元醇酯进展 夏咏梅 章克昌 方云 (无锡轻工大学 无锡 214036) 脂肪酸单甘油酯和脂肪酸糖(醇)酯是优良的食品和化妆品用乳化剂。化学生产方法都是以脂肪酸三甘油酯与甘油在200～240°C下，用碱催化剂催化甘油解反应来制备单甘酯；以脂肪酸与蔗糖或者失水山梨醇在200～250°C左右催化脱水成酯。为了获得良好的色泽和较高的纯度，需要进行较繁琐的脱色、蒸馏工序。 1985年来，随着非水相酶学研究的展开，酶法合成脂肪酸多元醇类非离子表面活性剂在近10年内也受到广泛瞩目。本文将介绍这一领域的最新进展。 1 酶法合成脂肪酸单甘酯(MG)进展 酶法合成MG的方法有：溶剂相或微乳状液中以脂肪酸和甘油进行酯化反应；非水相、微乳状液体系或超临界CO2中的甘油解油脂或酯交换反应，其中非水相甘油解也包括了报道最多的无溶剂法油脂甘油解。 Yamane[1,2]小组对酶法合成MG做了大量研究。其中有关油脂酶促甘油解的研究达到见报的最好水平。并在前期研究的基础上，用固定化酶催化橄榄油的甘油解。MG的平衡浓度以脱甘油的混合物计达90%，酶使用5次后活性才有较明显的降低。使用10次后MG平衡浓度仍可达60%。载体可选择粘土、CaCO3、CaSO4.2H2O及Ca2P2O7等，选择依据可能是反应所用的Chromobacterium viscosum和Pseudomonas pseudoalkali脂肪酶可以被Ca2+激活。本实验室也曾发现自产的假单胞菌脂肪酶在Ca2+或Mg2+的作用下，橄榄油水解酶活可为原来的1.5倍左右。 Jackson[3]等研究了在超临界CO2流体中，以Candida antarctica脂肪酶催化大豆油的甘油解、丙二醇解及甲醇解，最终单甘酯含量可达87%。醇的反应性正比于其在CO2流体中的溶解性，甘油的反应速度最慢，仅为甲醇的2%。超临界CO2中酶促油脂甘油解作为一种尝试是有益的，但由于其设备投资及操作成本，还有其工艺上的问题，比如为了满足体系的流动性，甘油过量达到7倍之多，所以其工业化的可行性比之常态下的酶促甘油解，要困难得多。 Goto等[4]以聚异丙烯酰胺树脂为载体制备固定化酶，研究了油酸和甘油的酯化反应。 Plou等[5]研究了Porciue pancreatic的固定化及其在甘油三油酸酯水解制备单甘酯和二甘酯中的应用。发现粘土作载体时活性最高，反应5h以后，单、二甘酯总和即达79%。 由于脂肪酶在某些有机溶剂中的稳定性尚可，除无溶剂法外，溶剂法即非水相酶促酯化或醇解反应也被用于MG制备，当然应严格控制体系水含量以抑制水解反应。在酯化反应中，多采用加入分子筛或减压反应的方法来移去生成的水，或者用在线吸附生成的MG及增加甘油与脂肪酸的接触(例如将甘油吸附在固体粉末状硅胶、活性碳或粘土上再与脂肪酸混合)来促进酯化反应[6]。短链脂肪酸往往在极性溶剂中酯化成MG的转化率较高，而在非极性溶剂中则二甘酯(DG)和三甘酯(TG)的产率较高。Dae等[7]考察了溶剂相中脂肪酸与甘油的酯化，发现在水溶液中水解油无位置特异性的脂肪酶在溶剂相中合成酯时也无特异性，而水解时呈1,3-位置专一性的，在溶剂相合成酯时也有专一性。 Yeh[8]等报道了在泡沫反应器中酶促甘油酯合成的反应，偏甘油酯的总产率近80%。 关于微乳状液体系或者反相胶束体系中的甘油解反应以及酯化反应的研究也有见报。目前普遍采用的是阴离子表面活性剂AOT体系。由于产品最终的纯化及平衡浓度等问题，这一类方法也很难工业化。此类研究与其它的微乳体系或反胶束体系酶促反应相似，处于数据积累阶段。 在酶法合成MG的研究报道中，最有希望工业化的还是工艺最简单的无溶剂法油脂甘油解。但1996年后的报道似乎离工业化比原来更远了，比原来更注重理论研究，其理由是反应物为整体的固体形态，不利于工业化，本实验室则通过工艺调整解决了这一问题。 根据本实验室的研究结果，用酶法工业化合成MG时，虽然MG产率可达90%以上，但如不经纯化工艺，要合成出含量高于90%的MG则较为困难。一方面这受到化学平衡转化率的限制；另一方面，当MG浓度很高时，它也是脂肪酶的底物。本实验室承担了国家九五工业攻关计划项目，生产出铜绿假单胞菌脂肪酶并研究了几种假单胞菌脂肪酶在MG及其它酯类产品合成上的应用。产物中MG含量与体系水含量、反应温度等关系很大。目前国产酶在同等酶活加入量上油脂甘油解活性虽然与进口酶相当，但比活仍较低。进口酶的高酶活则使得催化剂用量可以小于0.5%，有望省去酶的后去除工艺。我们在自制15L反应器中用脂肪酶催化合成MG，48h后MG含量达75%以上。 2 酶法合成脂肪山梨醇酯和脂肪酸糖酯进展 这一类表面活性剂的酶促合成研究起步更晚，主要原因是原料的不相溶性以及多羟基带来的选择性问题给合成带来很大困难。但是由于此类产品比之MG具有宽得多的HLB范围，应用范围更为广泛，所以研究价值较高，其化学合成工艺30多年来一直不断更新，但至今能生产出高品质产品的公司仍为数不多，国内厂家更是屈指可数。产品的纯化脱色工艺较复杂，且产品带有一定的焦糖味。关于失水山梨醇酯，即Span、Tween系列产品，山梨醇在反应中脱水成环，产物亲水性减小，需要通过环氧乙烷加成改性以提高其亲水性。 酶法合成由于其反应条件温和及酯化位置的相对专一性，比较有益于多元醇酯的合成，但仍受反应原料的不相溶性所限制。为了克服这一困难，大体上可分为三类合成方法： 第一类是将葡萄糖、果糖等转化为糖苷或缩醛化糖后再与脂肪酸或脂肪酸甲(乙)酯反应，以吡啶、苯等作溶剂，合成出糖苷或酰化糖的脂肪酸酯。在此工艺中，原料的相溶性初步解决了，但产品结构及溶剂残余量成为新问题，而且得率也不高。 第二类是不改变糖或糖醇的结构，而将脂肪酸三氯乙酯作为酰基供体，这一方法同样增多了反应步骤而且三氯乙醇的残余量也影响产品的应用。 第三类方法不改变原料结构，而是选择适当的溶剂，将反应物原料摩尔比放大多倍。此法产率较高，产物结构式与化学品相近或一致，但所用溶剂很贵，且原料配比也不适于工业化生产，但无论如何，综合几年来的报道，这类方法比之前两类更有可能工业化。 在单糖和糖醇酯的合成中，Ducret[9]等的研究结果是迄今为止最好的报道，醇酸摩尔比为1:1时，酯的产率为60%左右。他们用(Candida antarctica脂肪酶催化)合成了山梨醇、葡萄糖、果糖的油酸或月桂酸酯，并测定了它们的表面张力以及对O/W乳液的乳化力。值得注意的是，酶法合成的山梨醇酯的分子结构与化学法稍有不同。由于酶促反应的温度很低，山梨醇保留了开链结构，因而产物的亲水性会大于失水山梨醇酯，其HLB值亦可增大，对O/W乳液的乳化力也应增强。Ducret等的研究结果证实了这一点。实验表明，用酶法山梨醇酯乳化的O/W乳液，30℃下48h后分相体积为5%，而化学法产品乳化的对照样的分相体积为10%。他们采用的合成工艺是以往溶剂相酶促酯合成工艺的综合形式，即同时采用分子筛脱水和减压脱水来促进酯化反应。水含量的控制在其中尤为重要，体系必须维持少量水分以保证酶分子具有一定空间构型。溶剂2-甲基-2-丁醇和生成的水可形成恒沸物，减压下蒸出后用分子筛脱水，脱去水的溶剂再返回反应体系。 Skagerland[10]也用Candida antarctica脂肪酶在微乳状液体系中合成了6-O-十二酰基葡糖乙苷。醇酸摩尔比为1.6:1时，脂肪酸的转化率达77%，葡糖苷转化率达96%。与大多数微乳体系酶促反应不同的是，选用的乳化剂为钠皂。 二糖的酯合成比单糖或单糖的醇更难，其研究处于刚刚起步的阶段。不过因为酶法合成糖酯有可能获得较高的单酯含量，即可得到高HLB的糖酯，所以这一课题仍具有诱人的前景。 Oosterom等[11]用十二酸乙酯与二糖进行Candida antarctica脂肪酶的酶促反应，以特丁醇为溶剂，发现单酯比例及反应活性与二糖种类有关，主要与其溶解度有关。在试验的几种脂肪酶中，只有Candida antarctica脂肪酶可以催化蔗糖酯的合成，但是反应7d后也仅有37%的蔗糖转化率。 大多数酶法合成糖或糖醇酯的反应中所用脂肪酶多为Candida antarctica脂肪酶。不过， Sarney[12]则发现Mucor miehei和Chromobacterium viscosum脂肪酶也同样能催化蔗糖酯合成，但是蔗糖需先衍生化，而且最终蔗糖转化率仍然很低，仅20%左右。 糖或糖醇酯的合成目前基本上都是用非水溶剂法，以吡啶、DMF、THF或一些叔醇为多。考虑到有机溶剂中的酶活和对食品乳化剂以及脱溶剂工艺的要求，叔醇比较合适，但是成本偏高。不过溶剂法也比较有利于用固定化酶的连续生产。 3 小结 酶法合成脂肪酸多元醇酯是一条新的工艺路线。尽管至今仍无任何工业规模的尝试报道，但这一课题基于以下几点仍有探索价值。第一，基因工程的迅速发展有可能使脂肪酶催化剂成本降低且酶活增大。第二，单酯的高平衡浓度以及可合成化学法难合成的不饱和酸酯这些特性具有一定竞争力，而绿色产品的清洁生产则同样也是理由之一。今后国内要开展的工作除了在酶种本身上尽力缩短与进口酶差距外，在酶法合成工艺上仍需进行进一步探索。此外，对反应后酶活已损失很多或完全失活的酶的毒理以及酶蛋白分子与各种表面活性剂的相互作用关系尤其对表面物化性能的影响，这些问题国内外研究几乎都很少涉及，但却有较大的理论和实际意义。 目前有机化学界对固体反应及液固反应的兴趣日趋益浓，一旦有所突破，则蔗糖酯的酶法合成会找到一条崭新的路径，否则在目前情况下很难达到较高水平。 4 参考文献 [1] McNeill G P, Shimizu S, Yamane T. 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