Kinetics Studies On Polyphenoloxidase Catalize P-chlorophenol Oxidzing Reaction in onaqueous System Li Hua,Huo Ruizhen# (Department of Basic Science Xinjiang Aricultural University #Dept. of Appl. chem. South China Uaiv.of Ｔech) Abstract In experiment,the polyphenoloxidase was extracted from mushroom by using acetone precipitating method threetimes. And then, it was immobilized by using the absorbentdeposition method with porous glass powder as carriers,It wasstudied to catalize p-chlorophenol oxidizing reaction inchloroform, complys with Michaelis-Menten dynamicmodel.And themoisture content in organic solvent directly affected thecatalytic activity of mushroom polyphenoloxidase. Theoptimum reaction condition for the catalyrtic oxidation of p-chlorophenol in chloroform was determined: pH:7, temperature:25°C, moisture content: 0.5%(v/v)。Ｔhe measured value of dynamic parameters was 29.45kJ. mol-1 for apparent activationenergy,1.058mol. L-1 for Michaelis-Menten kinetics and 9.074×10-2 min-1 for the maximum reaction rate. Key words non-aqueous phase,polyphenoloxidase,kinetics 摘要 本文用丙酮沉淀法从蘑菇中提取多酚氧化酶，以多孔玻璃粉为载体，用吸附沉积法将酶固定，研究了该酶在氯仿介质中催化对氯苯酚氧化反应的机理遵循米氏(Michaelis-Menten)动力学方程；而且，在有机介质中含水率大小直接影响酶的催化活性。实验测得反应的最佳条件为 pH=7.0，温度为 25°C，含水率为 0.5％(v/v)；表观活化能 Ea=29.54kJ . mol-1，米氏常数 Km=1.058mol . dm-3，最大反应速率 rmax=90.74×10-3min-1。 关键词 非水相 多酚氧化酶 动力学 多酚氧化酶在非水相中催化对氯苯酚氧化反应的动力学研究 李华 霍瑞贞# (新疆农业大学基础部 乌鲁木齐 830052 #华南理工大学应用化学系 广州 510641) 酶催化效率高，反应条件温和，早已受到人们的重视，但在有机溶剂中酶易失活，所以大多数酶催化反应的研究均在水相介质中进行，而多数有机物难溶于水，有些目的产物在水相中又不能得到，而要在非水相中才能获得。如多酚氧化酶催化酚类物质的氧化反应： 水果、蔬菜的褐变就是由于果蔬类中含酚类物质和多酚氧化酶，破损时与氧气接触，发生上述反应而变为褐色。因此，在水相中无法得到邻醌类化合物或邻酚类物质，但在氯仿中酶催化反应生成的邻醌类化合物不易发生聚合，从而可得到邻醌类化合物。因此研究非水相酶催化反应很有必要。近来受到国内外科学工作者的重视。但对酶在非水相的催化动力学报导甚少。本文选取对氯苯酚作为底物，进行了蘑茹多酚氧化酶的催化动力学研究。 为开发利用非水相酶催化反应提供理论依据。在此基础上，我们已用非水相酶催化反应合成了药物L-多巴。 1 实验部分 1.1 多酚氧化酶的提取 用鲜蘑菇加冰水在高速组织捣碎机中打成浆， 经冷冻离心机4°C下离心， 取上清液，用3次丙酮沉淀法提取多酚氧化酶。经高真空低温冷冻干燥制得酶粉，于-4°C下存放，20天活力不变。 1.2 酶的固定化 取酶粉溶于pH=7的磷酸盐绶冲溶液中，用100～300目多孔玻璃粉为载体，用吸附沉积法将酶固定化。经固定化的酶活性高。 1.3 氯仿中酶活力的测定 在氯仿介质中，加入底物对氯苯酚，再加入固定化酶，利用磁力搅拌加强异相反应中底物和产物的扩散速度，终止反应后利用分光光度法测定400nm波长下产物的吸光度Ａ，以吸光度Ａ大小表示酶的活力。 1.4 初速率的确定 酶催化反应是一快速复杂反应，为了避免产物在反应进程中的干扰，常采用反应的初速率来进行研究。 实验测得多酚氧化酶的催化反应在0到5min内反应速率随时间变化呈直线关系，此直线的斜率即为ro。 2 结果与讨论 2.1 酶催化反应条件的选择 在氯仿介质中多酚氧化酶催化反应，主要受体系的温度、底物的浓度、酶用量及体系的含水率的影响，pH值及搅拌速度对酶催化反应也有影响；由于酶在有机介质中的催化反应依赖其微量水环境的pH值，故选用酶在水相中的最适pH值；搅拌速度在实验中用磁力搅拌器恒速搅拌。本文对温度(A)、底物浓度(B)、酶用量(C)、含水量(D)四个因素，设计了正交实验L 9(34)。通过极差分析选择出酶在有机介质中催化反应的最佳条件，结果如下：
表1 极差分析泟
水平结果 | 因 素
| A | B | C | D

K1

176 181 187 194
K2 212 192 195 199
K3 188 203 194 183
极差 36 22 8 16

由表结果可知，4 个因素中对反应速率的影响大小次序为 A＞B＞D＞C，即 4 个因素中温度影响最显著，酶用量影响最小。由正交实验得出氯仿介质中多酚氧化酶催化反应的最佳条件为 A2B3C2D2，即温度为 25°C，底物浓度为 0.05mol/l ，酶用量为 4m ｇ/ml，含水率为 0.5％。为了避免在选取水平值时将最佳值漏选，本文通过单因素试验对正交实验结果进行验证。单因素试验结果表明，与正交实验的结果相符，说明影响酶催化反应的各个因素之间的交互作用很小。这里要特别指出的是，在单因素试验中，含水率直接影响到酶的活性。无水条件下酶在有机介质中没有催化活性；当含水率开始增加时,酶的活性随之增加很快,当含水率增到0.5％(体积％)时，酶活性为最高；而后则缓慢减少。说明酶在有机介质中，进行酶催化反应的必要条件是保持一定的含水率。
2.2 有机介质中酶催化反应动力学参数的测定
2.2.1 表现活化能 Ea 的测定
在较低温度范围内， 酶催化反应速率随温度的升高而增加， 并符合 Arrhenius 公式：
或
式中k为速率常数，Ea为表观活化能，T为热力学温度，R为摩尔气体常数，ko为指前因子。
由上可知，以作图应得一直线，可由直线的斜率求出反应的表观活化能Ea。 由于ro与k成正比关系故以作图也应得一直线结果见表2和图1：
图 1 温度与反应速率的关系

表2 温度与初速率的关系
T/K | 283.15 | 288.15 | 291.15 | 293.15 | 296.15 | 298.15
T-1/10-3K-1 | 3.53 | 3.47 | 3.43 | 3.41 | 3.38 | 3.35
ro/10-3min-1 | 40.7 | 52.0 | 56.7 | 63.2 | 69.8 | 76.8
-Lnro | 3.201 | 2.956 | 2.870 | 2.761 | 2.662 | 2.566

经计算机线回归的结果如下：
Ea=29.54kJ . mol-1
相关系数 r=0.99
2.2.2 反应机理的探讨及动力学参数测定
多酚氧化酶催化对氯苯酚氧化反应是一双底物反应，但由于在敞开容器中空气中氧浓度大，反应过程中氧浓度近似不变，即成为准单底物反应，本文以单底物反应机理来描述。
由于 rmax 和 KM 是酶学中的重要参数，为求这两个参数可将米氏方程变为双倒数形式：
实验在不同底物(对氯苯酚)浓度[So]下测定相应的反应初速率ro，并以对作图，结果见表 3 和图 3

表 3 反应初速率与底物浓度的关系泜
[So]/mol . L-1 | 0.01 | 0.016 | 0.02 | 0.025 | 0.04
ro/10-3min-1 | 49.2 | 58.7 | 64.3 | 67.7 | 75.8
[So]-1/L·mol-1 | 100.0 | 62.5 | 50 | 40 | 25
r-1o/min | 20.32 | 17.04 | 15.55 | 14.77 | 13.19

从图 2 中得知，r-1o 对[So]-1 作图得一直线，说明氯仿介质中多酚氧化酶催化对氯苯酚氧化反应机理可用米氏方程来描述。根据图中直线的斜率和截距，经计算机线性回归求出酶学的重要参数 KM 和 rmax
米氏常数 KM＝1.058mol．l-1
最大反应速率 rmax＝90.74×10-3min-1
相关系数 R＝0.99
图 2 底物浓度与反应速率的关系
3 参考文献
[1] Smith J L,Kreuger R C.J Biol Chem, 1962,237:1699.
[2] Kazandjian R Z,et al.J Am Chem Soc, 1985,82:3192.
[3] Sergio Riva, Joel Chopinean,AP G Kieboom,Klubabiv A M J.Chem Soc,1988,110:584-589.
[4] Cambon B,et al. J. Am Chem Soc 1984,106:2687.

李华

男，38 岁，副教授，硕士，主要从事化学动力学和有机合成的研究和教学工作。