Studies on Mimic L-Malydrogenase Constructed by b-Cyclodextrin Derivative Shen Jingru, Sun Xiaomei, Lei Zhuolin, Wang Qiuli, Ding Zhigang (South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074) Abstract Mimic L-malate dehydrogenase was constructed by the reaction of b-cyclodextrin, m-carbonyl benzenesulfonyl chlorid with iron trichloride. Oxaloacetic acid can be obtained by oxidative dehydrogenation of L-malic acid catalyzed by mimic enzyme in water. Key words b-cyclodextrin, Iron(Ⅲ), Mimic L-malate dehydrogenase, L-malic acid, Mimic enzyme. 摘要 采用 b-环糊精(b-cyclodextrin,缩写：b-CD)二间羧基苯磺酸酯同三氯化铁形成的配合物构筑模拟苹果酸脱氢酶，将苹果酸催化氧化生成草酰乙酸，模拟苹果酸在生物体内三羧酸循环中最后一步氧化还原反应取得成功,求得模拟酶的米氏常数为8.74 mmol.L-1。并研究了反应条件对模拟酶催化反应速度的影响。 关键词 b-环糊精 铁(Ⅲ) 模拟苹果酸脱氢酶 L-苹果酸 模拟酶 b-环糊精构筑模拟苹果酸脱氢酶的研究 沈静茹 孙小梅 雷灼霖 王秋丽 丁志刚 (中南民族学院化学系 武汉 430074) 开发具有与酶功能相似的人工酶已成为化学领域的热门课题之一。可以作为脱辅基酶蛋白代用品的分子虽有若干种，迄今被广泛采用且较为优越的是环糊精体系。环糊精构筑的作为氧化还原酶的酶模型不如水解酶多,它们的作用各不相同，有的是模拟NADH 还原茚三酮[1]，有的能可逆结合分子氧，并有较长的半衰期[2,3]，有的作为铁氧化还原蛋白酶模型[4,5]，但作为模拟苹果酸脱氢酶的酶模型未见报道。 本文是以间羧基苯磺酰氯修饰 b-CD的产物，与三氯化铁反应，制得双(6-氧-间羧基苯磺酰基)-b-CD.Fe3+ 配合物构筑模拟L-苹果酸脱氢酶，将L-苹果酸催化氧化生成草酰乙酸。模拟了苹果酸在生物体内三羧酸循环中最后一步氧化还原反应,借助氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)作为氢的受体，反应中生成的还原型辅酶Ⅰ(NADH)量与L-苹果酸量间呈一定化学计量关系， 可通过在 340nm 处测定NADH的吸光值变化求出苹果酸的消耗量或草酰乙酸的生成量。 在标准热力学条件下，反应平衡有利于逆反应，因生理情况下，反应产物草酰乙酸不断合成柠檬酸而移去，使其在细胞中的浓度降低，反应向正反应进行[6]。笔者在模拟酶的催化反应中加入截获剂(2,4-二硝基苯肼)，在pH 9.00的甘氨酸-NaOH缓冲溶液中使草酰乙酸转变为草酰乙酸腙，促使反应也向正反应进行[7]。 其反应式如下： 1 实验 1.1 仪器与试剂 岛津AA-646原子吸收光谱仪，AIC UV-9100型紫外-可见分光光度计(深圳爱克分析仪器有限公司)，pHS-3C数字酸度计(杭州万达仪器仪表厂)，β-CD为苏州味精厂工业品经两次重结晶，L-苹果酸、L-苹果酸脱氢酶，生化试剂(SIGMA CHEMICAL CO.)，NAD，生化试剂(上海伯奥生物科技公司)，2,4-二硝基苯肼，分析纯(上海化学试剂总厂)。其余试剂均为分析纯。 1.2 模拟酶的合成 配制0.11mol.L-1 b-CD-(M)2(合成和结构鉴定结果：核磁共振光谱及元素分析数据参看文献[8])水溶液30mL，0.48 mol.L-1 FeCl3水溶液40mL，将FeCl3溶液全部加入搅拌下的 b-CD-(M)2溶液中，此时，溶液由无色逐渐变为黄色，最后得一橙红色透明溶液。将此溶液置恒温水浴锅中，于70°C恒温8h冷却，过滤。向滤液中加入适量丙酮，析出淡黄色絮状沉淀。静置过滤，用95%乙醇洗涤至滤液中无Cl-止，抽干后置于干燥器中，得干燥淡黄色粉状固体即:b-CD-(M)2.Fe3+重4.6g，产率88%。经薄层层析紫外检测所呈斑点的Rf=0.66(展开剂：乙酸乙酯:甲醇:冰醋酸:水＝12:3:3:2)，红外 g max：3300cm-1(s,OH)，2900cm-1(w，CH2)，1720cm-1(w,C=O)，1625，750cm-1(mw,苯环)，1143cm-1(w，ArSO2)，原子吸收光度法测出Fe3+的量，证明配合物中 b-CD-(M)2与Fe3+的摩尔比为1∶1，MÖssbauer谱证明是Fe3+状态。 1.3 模拟酶的催化反应 1.3.1催化反应 在比色皿中分别加入pH 9.00的甘氨酸(Glycine)-NaOH缓冲液(含2,4-二硝基苯肼)3mL，1mol.L-1的NAD+ 50 m L，4.44mmol.L-1模拟酶30 m L，1mol.L-1的苹果酸30 m L，混匀，反应温度25°C，以30 m L缓冲液代替底物L-苹果酸的溶液作对应参比，在NADH最大吸收340nm处测A340值。对比实验：用FeCl3代替模拟酶，其它条件与前述相同。 1.3.2底物浓度对模拟酶催化反应速率的影响──用双倒数作图法求模拟酶的米氏常数 在比色皿中，分别加入pH 9.00的甘氨酸-NaOH缓冲液2.7 mL，1mol.L-1的NAD+ 200 m L，0.523mol.L-1的2,4-二硝基苯肼30 m L，4.44mmol.L-1的模拟酶30 m L和不同量的底物(苹果酸)作为测量池,在反应温度25°C条件下，同样用不加底物的溶液作对应参比(均用缓冲液定容至3.10mL),测A340值,并求得催化速率，即：V＝D C/D t＝D A/ε.D t,式中:e 为NADH的摩尔吸光系数,在340nm处为6.3×10-6 L/mmol.cm-1[9]，底物浓度[S]已知，由1/V对1/[S]作图求得模拟酶的米氏常数Km。 1.4 条件实验 1.4.1 pH值对模拟酶反应速度的影响 在比色皿中,分别加入pH值为8.79,9.00,9.50,10.00和10.70的甘氨酸-NaOH缓冲液2.7mL，1mol.L-1的NAD+ 50 m L，0.523 mol.L-1的2,4-二硝基苯肼30μL，4.44 mmol.L-1的模拟酶30 m L，1mol.L-1 L-苹果酸30 m L，混匀后以对应空白(即以相应pH值的缓冲液代替底物)为参比，测其A340的变化。 1.4.2 模拟酶浓度对模拟酶反应速度的影响 在比色皿中加入2.7mL pH9.00的甘氨酸-NaOH缓冲液，1mol.L-1 的NAD+ 50 m L，0.523 mol.L-1的2,4-二硝基苯肼30 m L，1 mol.L-1 L-苹果酸20 m L，4.44mmol.L-1的模拟酶分别取10,15,30,40,50,60,70 m L,用缓冲液定容总体积为2.90mL，混匀后以对应空白(即以pH=9.00的缓冲液代替底物)为参比,测其A340的变化。 1.4.3 2,4-二硝基苯肼浓度对模拟酶催化速度的影响 在比色皿中加入2.7mLpH=9.00的甘氨酸-NaOH缓冲液，1 mol.L-1 的NAD+ 50 m L，4.44mmol.L-1的模拟酶30 m L,1mol.L-1 L-苹果酸30 m L，0.523mol.L-1的2,4-二硝基苯肼分别取10,15,20,25,30,40,50,60,70 m L，用缓冲液定容总体积为2.90mL，混匀后以对应空白(以pH=9.00的缓冲液代替底物)为参比，测其A340的变化。 1.5 对照实验 用1/100浓度的 SIGMA 公司经透析后L-苹果酸脱氢酶原酶液30 m L代替模拟酶，同在25°C条件下，并确保其他实验条件相同，测定生物酶在此体系中的米氏常数Km值。 2 结果与讨论 2.1 催化速率
| 图1 模拟酶催化苹果酸的动力学曲线 a 模拟酶(▲) b FeCl3(■)
图1结果可见模拟酶的催化速度比FeCl3快得多，而曲线a表明了模拟酶将L-苹果酸催化氧化生成草酰乙酸的催化动力学过程，且催化反应在6 min前速度很快，基本呈线性，6 min以后反应速度增加缓慢, 最后趋于不变，表明反应已进行完全。故计算催化速率时 D t选择5min以内。为了便于在测定米氏常数中与生物酶对照，我们在生物酶的测定最佳酸度pH=9.00处测定，若在模拟酶的最佳酸度pH=9.50处测定，催化速率更快。 2.2 反应条件 在条件实验中，从图2可知pH值对体系的催化反应有一最适宜酸度，即pH 9.5，大于或小于此值， 体系的催化能力均有不同程度的下降，而生物酶的最适pH值为9.00，这也说明模拟酶在这方面与生物酶较为接近。图3曲线a表明，当底物L-苹果酸的浓度一定时, 模拟酶的浓度与反应速度成正比；曲线b表明在此反应体系中，2,4- 二硝基苯肼的加入量有一最佳值(4.46mmol.L-1)。
| 图2 酸度对反应速度的影响 |  | 图3 模拟酶和肼的浓度对反应速度的影响 a 模拟酶(C×10-5mol.L-1)(▲) b 肼(C×10-3mol.L-1)(■)
2.3 模拟酶与生物酶在相同催化条件下的Km值 根据双倒数作图法[10]，米氏方程可写为以下形式：V-1＝Km.Vmax-1.[S]-1 + Vmax-1。 笔者通过实验，选择不同的[S]测定相对应的V，求出两者的倒数，以1/V对1/[S]作图，给出直线(见图4)，其直线方程分别为：Va-1=0.0307[S]-1+3.5142(模拟酶)和Vb-1=0.0325[S]-1+4.2738(生物酶)，因此，可求得生物酶的米氏常数(km)生物酶＝0.0325/4.2738＝7.60mmol.L-1，模拟酶的米氏常数(km)模拟酶＝0.0307/3.5142＝8.74mmol.L-1。km的值愈小，表明酶对底物亲和力愈大[11]，显然此时不需要很高的底物浓度就可以很容易地达到酶促反应的最大速度Vmax。根据所求得米氏常数进行比较，可知：(Km)模拟酶∶(Km)生物酶＝1.15∶1，这表明模拟酶对底物的亲和力比生物酶稍弱些，但很接近。
| 图4 Lineweaxer-Burk双倒数作图法 a 模拟酶(▲) b 生物酶(苹果酸脱氢酶)(■)
酶活力的大小可用一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即酶催化的反应速度愈快，酶的活力就愈高。从图2可看出，1.332×10-4mmol模拟酶在25°C，pH=9.00的条件下对酶促反应速度最高可达2.34 mol/L.min,而用1/100纯生物酶原酶液30 m L在相同条件下，在此体系中对酶促反应的最大反应速率达0.287 mol/L.min，显然，用1.332×10-4mmol模拟酶催化此反应，最大反应速率比1/100生物酶原酶液30 m L催化此反应的最大反应速率高8倍。 2.4 小结 综上所述，b-CD-(M)2.Fe3+ 成功地模拟了生物体内三羧酸循环中最后一步氧化还原反应。模拟了L-苹果酸脱氢酶，在常温下，迅速使L-苹果酸脱氢，生成草酰乙酸，其它无机催化剂却不行(如FeCl3)，可达到生物酶在此体系同一数量级的催化效能， 生物酶的米氏常数为7.60 mmol.L-1，模拟酶的米氏常数为8.74 mmol.L-1。且在反应产物中加入一定量的丙酮等有机溶剂，模拟酶会析出，借此将模拟酶与产物分离， 回收的模拟酶与FeCl3反应再生后，用于催化氧化苹果酸，其催化效能无明显影响。 模拟酶制备容易，使用方便，价格便宜，无毒无害，既克服了生物酶受环境影响较大的缺陷，又可回收再生，循环使用。可以说这是一种大有发展前途的人工合成仿生化合物。 3 参考文献 [1] Yoon C J,Ikeda H, Kojin R et al. J.Chem.Soc.Chem Commun.,1986, 1080. [2] Kuroda Y,Hiroshige T,Sera T et al. J. Am.Chem.Soc.,1989,111:1918. [3] Kuroda Y,Hiroshige T,Sera T et al. Carbohydr.Res., 1989,192:347. [4] Siegel B. J.Inorg.Nucl.Chem., 1979,41:609. [5] Kuroda Y,Sasaki Y,Shiroiwa Y et al. J.Am.Chem.Soc., 1988,110:4049. [6] 沈同, 王镜岩. 生物化学(下册). 北京:高等教育出版社,1995:99. [7] Townshend A,Vaughan A. Talanta ,1970,17:299. [8] 丁志刚.刘学群等.化学学报,1995, 53:578-582. [9] 李疏琦.现代酶法分析.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社出版,1994:93. [10] Lineweaver H,burk D.J. J.Am.Chem.Soc., 1934,6:658. [11] 沈同,王镜岩.生物化学(上册). 北京:高等教育出版社, 1995:251. 沈静茹 女，34岁，回族，副教授，从事生物有机化学研究。湖北省自然科学基金资助项目(95J60)。