Progresses on Nucleic Acids Site Specif ic Cleavage Agents Wan Rong, Chen Jing, Zhao Gang, Ma Yuan, Jiang Yuyang, Zhao Yufen (Bioorganic Phosphorus Chemistry Laboratory, Department of Chemistry, School of Life Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084) Abstract In the past decade, studies on nucleic acids site-specific cleavage agents, which consist of cleavage and recognition systems, had been received significant attention in the field of chemistry, biochemistry and molecular biology. The recent related research progresses are reviewed. The factors that influence the cleavage activity and site-specificity are discussed. And the suggestion for the future research is proposed also. Key words Site-specific cleavage, Cleavage system, Recognition system, Cleavage activity, Site-specificity 摘要 近 10 年来，核酸定点切割试剂的研究引起了化学、生物化学和分子生物学等领域的广泛关注，并已成为研究的热点。本文综述了定点切割试剂及其两个组成部分——切割系统和识别系统的研究现状，讨论了影响其切割活性和位置专一性的因素，并提出了今后研究的方向。 关键词 定点切割 切割系统 识别系统 切割活性 位置专一性 核酸定点切割试剂研究进展 万荣 陈晶 赵刚 麻远 蒋宇扬 赵玉芬 (清华大学生命科学与工程研究院，化学系生命有机磷化学教育部开放实验室 北京 100084) 1 导言 近 10 年来，核酸定点切割试剂的研究引起了化学、生物化学和分子生物学等领域的广泛关注，并已成为研究的热点[1,2]。所谓核酸定点切割试剂，即可以使核酸底物在某个特定位置发生断裂的试剂。它由两部分组成：第一部分叫做切割系统，也即某种核酸切割试剂；第二部分叫做识别系统，由可以识别核酸底物的特定核苷酸序列的某种分子组成。 核酸定点切割试剂具有非常重要的应用价值。首先，它在疾病的基因治疗中大有用武之地。基因治疗的基础是反义技术[3]，即基因专一性地使表达有害蛋白的 mRNA 失活或者解体，从而抑制有害蛋白的合成而达到治疗疾病的目的。具体的做法是采用适当的定点切割试剂作用于靶 mRNA 上，使靶 mRNA 被切断而失活。其次，定点切割试剂还可以作为重要的分子生物学工具。限制性内切酶所能识别的碱基序列非常短，只有 4、6 或 8 个碱基对。因此，在较长的核酸链中，这样短的识别序列出现的频率会很高。所以当一条较长的核酸链被限制性内切酶切断时，将产生非常多的碎片，这些碎片是很难被进一步利用的。相比之下，定点切割试剂的识别系统可识别的底物核苷酸序列可以远远地大于 8 个碱基(对)，因而其专一性比限制性内切酶要高得多，所产生的切割碎片很少，进一步利用非常方便。这种高度的专一性使得定点切割试剂可以作为分子生物学中一种具有广泛应用价值的工具，因此它又被称为人工工具酶。 2 切割系统 目前的切割系统按照切割机理主要分为自由基型、磷酸酯水解型和消除型 3 大类[2]。 自由基型的切割系统可以产生某种自由基，然后进攻核酸中的糖环或是碱基，导致其氧化破坏，进而使核酸链发生断裂。常见的这类系统有 EDTA-Fe2+/H2O2 体系、1,10-二氮杂菲(phen)－亚铜离子络合物[Cu(phen)2+]、Cu2+/硫醇体系、金属离子-卟啉络合物、金属离子-寡肽络合物以及抗生素等。这类切割系统存在着一个严重的缺点，即切割产生的碎片不能再用连接酶连接起来，因而很难再被进一步利用。 水解型的切割系统一般都可以提供某种亲核基团(如羟基)。对 DNA 而言，该基团直接进攻磷原子而使磷酸酯水解，同时 DNA 断裂；而对 RNA 而言，该基团则促使核糖环上 2’-OH 脱质子化形成 2’-O-，然后由它进攻3’-位上的磷酸二酯基团而发生分子内转酯反应形成 2’,3’-环磷酸酯，同时RNA断裂。目前RNA的水解型切割系统比较多，如核酸酶模拟物、金属离子(尤其是镧系离子)及其络合物、二胺和多元胺以及含有碱性氨基酸残基的多肽等。相比之下，DNA 的水解型切割系统还非常少，目前只有两类：一类是含铈离子及其络合物的体系；另一类是赵玉芬等发现的丝组二肽体系[4,5]。水解型切割系统对核酸的切割与天然的核酸酶相似，产生的碎片可以用连接酶连接起来进一步利用。 消除型的切割系统目前只发现了两例，分别为赖色赖三肽和赖酪赖三肽。它们可以识别 DNA 中的脱碱基部位，并在该部位产生切口，其机理为 b-反式消除。 3 识别系统 现已发展了多种识别系统，包括寡聚核苷酸、多肽核酸(PNA)、胍基核酸(deoxyribonucleic guanidine, DNG)、多聚酰胺、DNA 结合蛋白或多肽等，分别介绍如下。 3.1 寡聚核苷酸 寡聚核苷酸可以通过 Watson-Crick 碱基互补配对分别与单链或是双链的核酸底物形成双螺旋或是三螺旋，从而识别底物的碱基序列。 3.2 PNA PNA 是一种 DNA 类似物，它以电中性的肽键骨架取代了 DNA 中电负性的脱氧核糖磷酸骨架(如图 1)。PNA 可以与互补的 DNA、RNA 或 PNA 形成类似 DNA 双螺旋的结构，并遵守 Watson-Crick 碱基配对原则[6]。PNA 与互补的核酸链结合具有亲和性高、特异性强及稳定性好等特点；而且PNA既不被核酸酶水解，也不被蛋白酶水解，因而由它制得的定点切割试剂进入生物活体后具有相当好的稳定性。 图 1 PNA、DNG 与 DNA 的结构比较 3.3 DNG DNG 也是一种 DNA 的类似物，它以胍基骨架取代了 DNA 中的磷酸二酯骨架(如图 1)[7]。DNG 可以与互补的 DNA 或 RNA 单链形成双螺旋结构，也可以和 DNA 双链形成三螺旋，并遵守 Watson-Crick 碱基配对原则。由于 DNG 中的胍基骨架带正电荷，而 DNA 或 RNA 中的磷酸二酯骨架带负电荷，因此 DNG 相比于 PNA 而言，与 DNA 或 RNA 的亲和性更高，形成的复合物具有高度的稳定性。此外，DNG 也不被核酸酶和蛋白酶水解，因而在生物活体中很稳定。 3.4 多聚酰胺 多聚酰胺含有多个 N-甲基吡咯(Py)、N-甲基-3-羟基吡咯(Hp)和 N-甲基咪唑(Im)单元以及一个g-氨基丁酸(如图 2)。g-氨基丁酸的存在可以使多聚酰胺形成头针状(hairpin)的反平行结构，该结构可以与双链 DNA 的小沟结合而发挥识别作用。1998 年 Dervan 提出了多聚酰胺识别 DNA 碱基对的规则：反平行成对的 Im/Py 识别 G-C 碱基对，反之 Py/Im 则识别 C-G 碱基对；反平行成对的 Py/Hp 识别 A-T 碱基对，反之 Hp/Py 则识别 T-A 碱基对(如图 3)[8]。 图2 多聚酰胺的结构 图3 多聚酰胺对DNA双链的识别作用示意图 3.5 DNA 结合蛋白和多肽 许多天然存在的蛋白质和多肽能与 DNA 特定部位结合，它们称为 DNA 结合蛋白。目前根据它们与 DNA 结合部位的结构特征，一般将其分为以下 3 类： 3.5.1 “螺旋转折螺旋”型结构域(helix-turn-helix motif) 该结构模型由 Anderson 于 1981 年提出[9]，目前已有大量的晶体结构证实了这一结构域模型。该结构域一般含有 20 个氨基酸残基，包括两个 a-螺旋，由一个转折相连接。其中一条螺旋的氨基酸残基与 DNA 大沟中的碱基直接接触，称为识别螺旋；另一条螺旋跨卧在大沟上，与 DNA 分子的结合是非特异性的。 3.5.2 “锌指”型结构域(zinc-finger-motif) 该结构由 Miller 等在研究瓜蟾属转录因子 IIIA(TFIIIA)分子时发现[10]，该分子含 7-11 个锌原子和 9 个结构相似的重复单位，每个单位约含有 30 个氨基酸残基，一般含有比较保守的两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基，它们与锌形成四面体配位。 3.5.3 “亮氨酸拉链”型结构域(leucin-zipper motif) 1988 年 Landschulz 等提出“亮氨酸拉链”型结构域[11]。这类蛋白质含有 4 个或 5 个亮氨酸残基，它们之间准确地相隔 7 个氨基酸，这些亮氨酸残基沿 a-螺旋的轴向排成一列。该蛋白与 DNA 的大沟结合。 除了上面介绍的几种识别系统以外，还有其它一些识别系统，如能够与 DNA 小沟结合的物质(如偏端霉素 distamycin)和碱基扦插试剂(如吖啶)等。 4 定点切割试剂 将切割系统和识别系统通过某种具有适当长度的分子(称为连接手臂)共价连接在一起后，便可以得到定点切割试剂。衡量定点切割试剂的优劣有两个标准：一是其切割活性；二是其位置专一性。为了使其具有较高的切割活性，在设计时应注意以下 4 点： (1)切割系统对识别系统不应有切割作用，否则定点切割试剂会发生自我切割反应而导致其识别系统断裂。 (2)当使用寡聚核苷酸、PNA、多聚酰胺和 DNG 作为识别系统时，应尽可能地将切割系统连在识别系统的中间。因为这些识别系统都是靠其上的碱基或者是芳香环来识别底物的，它们与底物结合的强弱与这些碱基或者芳香环的多少呈正相关。当切割系统连在识别系统的中间时，切割反应一发生底物便被切成两个甚至多个片段，识别系统上与每个片段相结合的碱基或者芳香环的数目都较原来的要少，因此比较容易从识别系统上离解下来。这有利于定点切割试剂游离出来再与另一个底物分子发生反应，从而可以提高切割效率。当然，与把切割系统连在识别系统的两端相比，将其连在中间往往在合成上更难，因此需要综合考虑切割效率与合成难度这两个因素。 (3)识别系统与底物的结合能力不能太强，否则当切割反应发生后，定点切割试剂无法与被切断的底物碎片离解开来，从而使之不能切割别的底物分子。 (4)连接手臂不能过短，其刚性也不能太大，否则切割系统无法接触到底物，会使切割活性减小甚至丧失。 定点切割试剂位置专一性的高低主要取决于下面 3 个因素： (1)识别系统与底物结合的序列特异性的高低直接决定了位置专一性的好坏。寡聚核苷酸、PNA、多聚酰胺和 DNG 对核酸底物识别的特异性都相当高，可以作为性能良好的识别系统。而能与 DNA 小沟结合的试剂和碱基扦插剂识别底物的特异性都较差而很少应用。 (2)连接手臂过长或是柔性过大都会导致切割系统无法在底物上准确定位，从而使得位置专一性下降。 (3)切割系统的类型也会影响位置专一性。当切割系统为自由基型时，如果生成的活性自由基很容易扩散，那么它将使邻近切割系统的多个底物位点都发生断裂而降低位置专一性；当切割系统为水解型时则没有这种缺点。 目前只有一小部分定点切割试剂可以使底物在唯一的位点上发生断裂而真正做到定点切割；其它许多定点切割试剂的位置专一性都不是非常好，只能做到序列特异性切割，也就是使底物在某段特殊的核苷酸序列中的少数几个位点上发生断裂。 根据切割系统和识别系统的来源，定点切割试剂可以分为三大类：一类是这两个系统都是天然的；另一类是这两个系统中有一个是天然的；第三类是这两个系统都是合成的。 切割系统和识别系统都是天然的情况比较少见，一般由核酸酶和 DNA 结合蛋白组成。Schultz 等曾将葡萄球菌酶 SNase 和一个 DNA 结合蛋白——l 阻遏蛋白相连，得到的定点切割试剂可以定点切割双链 DNA[12]。 第二类定点切割试剂包括两种，其中之一是将天然的核酸酶连在合成的识别系统上。Zuckermann 和 Schultz 曾报道将 SNase 的一种点突变体(Lys116 突变成 Cys116)通过二硫键连在一个 14 聚的 DNA 的 3'-端，然后作用在一个 59 聚的单链 RNA 底物上，使底物发生了序列特异性切割。不过他们发现，这种半合成定点切割试剂的切割效率随着切割反应的进行而明显下降，这是因为 SNase 可以切割 DNA，因此将识别系统降解了。为了解决这一问题，他们使用 RNase S 代替了 SNase，因为前者只切割 RNA，果然得到了较好的结果[13]。Kanaya 等则将大肠杆菌 RNase H 连到一个 9 聚的 DNA 的 5’-端上，使一个 9 聚的 RNA 在其第 5 和第 6 个核苷酸之间产生了定点切割[14]。第二类定点切割试剂的另外一种情形是将合成的切割系统连在天然的 DNA 结合蛋白上。大肠杆菌中含有一种基因激活蛋白，它含有“螺旋转折螺旋”型结构域，能与 DNA 发生特异性的结合。Ebright 等人利用其上的一个半胱氨酸残基与[Cu(phen)2+]偶合，得到的切割试剂可以定点切割 DNA[15]。Sigman 的研究小组则将[Cu(phen)2+]与大肠杆菌中的一个 DNA 结合蛋白偶合，得到的试剂可以序列特异性地切割 DNA 底物[16]。Nagaoka 等人[17]以及 Dervan 的研究小组[18]分别将甘甘组三肽与 Ni2+或 Cu2+离子的络合物连接到一个具有锌指结构的 DNA 结合蛋白或是 Hin 重组酶的 N-端，得到的试剂对 DNA 的切割同样具有序列特异性。 第三类定点切割试剂与前两类相比最为常见，它往往由切割试剂和寡聚 DNA 偶合而成。 有关核酸(主要是 DNA)的自由基型定点切割试剂的报道较多，这里举两个例子。1985 年，Orgel 的研究小组将乙二胺四乙酸连接到一个 16 聚的 DNA 的 5’-端，所得的切割试剂在 Fe2+和二硫苏糖醇的存在下可以对一个 37 聚的 DNA 单链进行序列特异性切割，切割位点只有两个，如图 4 中的两个箭头所示[19]。1993 年 Groves 等将 2,6-二羧基吡啶与 Fe2+的络合物连到寡聚 DNA 上后，在氧气和还原剂存在下可以序列特异性地切割 135 聚的 DNA 底物[20]。 图 4 EDTA-Fe2+与寡聚 DNA 偶合形成的定点切割试剂切割 DNA 单链示意图 1994 年，Bashkin 等报道了第一例水解型定点切割试剂。他们将一个三吡啶的衍生物连在一段 17 聚的 DNA 的中部，然后在 Cu2+的存在下切割 159 聚的 RNA 底物，结果切割只发生在两个位点上，如图 5 中两个箭头所示，箭头的长短代表切割程度的大小[21]。此后不久，Matsumura 等将亚胺基二乙酸基团(可以络合镧系金属离子)连在 15 聚的 DNA 上，在镧系离子存在下，可以序列特异性切割39聚的 RNA[22]。Magda 等将 Eu3+[23]和 Dy3+[24]的络合物连到寡聚 DNA 上对 RNA 底物进行定点切割，也获得了很好的结果。Hall 等人则将 Eu3+的另一种络合物连到 20 聚的 DNA 上作为定点切割试剂[25]。 图5 三吡啶衍生物与寡聚 DNA 偶合形成的定点切割试剂切割 DNA 单链示意图 除了含有金属离子的定点切割试剂以外，还有许多不含金属离子的水解型定点切割试剂。Komiyama 的研究小组将两段寡聚 DNA 连接到一个碳原子上，然后将乙二撑三胺也连接到同一个碳上，得到了一个 RNA 定点切割试剂，它可以使底物在两个相邻的位点产生断裂[26]。类似的，他们又将乙二胺与一个 19 聚的寡聚 DNA 的 5’-端相连，所得试剂可序列选择性切割一个 30 聚的 RNA[27]，并且可以对 tRNA 产生定点切割[28]。Silnikov 等人将一种含有两个咪唑基的化合物连接到寡聚 DNA 的 3’-端或是 5’-端，所得的试剂可以对 tRNA 进行定点切割[29]。 除了使用寡聚 DNA 作为识别系统以外，也可以使用寡聚 RNA。Sigman 的研究小组将[Cu(phen)2+]与一段 RNA 相连后用于切割单链或是双链的 DNA，得到了较好的序列特异性的切割结果[30]。 5 展望 目前已经合成出了各种各样的定点切割试剂，但大多数的活性都不高，与天然的核酸酶相去甚远。天然的核酸酶都有非常高的催化转化量(catalytic turnover)，即一个酶分子可以催化许多个底物分子水解。而现在的定点切割试剂的转化量都很低，甚至往往需要定点切割试剂的浓度高于底物浓度才能观察到明显的切割效应。此外，现在的许多定点切割试剂的位置专一性还不够高，难以真正做到定点切割。因此，进一步提高定点切割试剂的活性和专一性是今后研究的方向之一。 现在的研究发现，绝大部分金属离子或是其络合物只能切割单链 RNA。由此人们发展了一种提高 RNA 定点切割试剂活性的办法，即设计特殊的识别系统，让它与底物 RNA 结合成双链时能使底物在切割位点处产生隆起(如图 6)。底物的隆起部位是单链的，有利于提高切割活性[31]。 图 6 RNA 底物上产生隆起有利于提高切割活性 除了应该提高定点切割试剂的活性与专一性以外，将其导入生物活体中进行切割反应也是今后研究的一个重要目标。目前除了限制性内切酶所催化的反应外，其它所有的定点切割反应都是发生在生物体外的，而要使定点切割试剂具有更为广泛的用途，就必须让它可以直接作用于生物体内的核酸底物。这就要求切割系统和识别系统都具有良好的透膜性，并且要在细胞中稳定。 6 参考文献 [1] Trawick 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