The progress of the derivatization methods of carbohydrate Huang Fang, Liu Xiaoling, Zhou Guangjun#, Wu Xia, Yang Jinghe** (College of Chemistry, Shandong University, Lab. Colloid & Interface Chem. of Educational Ministry #Shandong Supervision & Inspection Institute for Product Quality) Abstract Carbohydrate chemistry is one of the most important fields of the biochemistry. The development of the derivatization of carbohydrates is reviewed in this paper, including the derivatization methods and their application in chromatography. 25 references are cited. The trend is also discussed. Key words carbohydrate, derivatization, review 摘要 糖化学是生物化学中的一个重要前沿研究领域，近年来在这一方面的研究有了突飞猛进的发展。本文综合论述了糖类物质的衍生化技术及其应用，并对其未来的发展进行了展望。 关键词 糖 衍生化 综述 糖类衍生化技术的研究进展* 黄方 刘晓崚 周广军# 吴霞 杨景和** (山东大学化学院 教育部胶体与界面化学重点实验室 #山东省产品质量监督检验所 250100) 糖是存在于所有生物体中的一类独特物质，近年来随着对糖类认识的深入，大量的实验结果揭示了糖类是携带着最大信息量的一类生物分子，在生物体内发挥着多方面的生理作用。因此，有人称糖生物学将是生物化学中最后一个重大的研究前沿课题。 糖类的分离一般采用色谱技术，如气液色谱(GLC)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、超临界色谱(SFC)及毛细管电泳(CE)。近年来发展最为迅速的是 HPLC 和 CE，它们具有分离效率高、分析时间短、进样量少、检测限低、多模式等特点。然而糖类的检测比较困难，因为糖既无强的 UV 吸收，又无荧光基团，而且在通常情况下为电中性。因此糖类的检测通常需要先进行衍生化，使之具有 UV 吸收、荧光特性或其它一些可测定的物理化学性质。由此可见衍生化技术对糖类分析的发展至关重要。 1 糖类的衍生化技术 糖类衍生化的方法很多，根据衍生化原理的不同可以分为以下几个类型。 1.1 与胺及类胺化合物反应进行衍生化 与胺类化合物的反应是糖类测定最早使用的衍生化方法之一，其原理是-NH2 与糖的官能团——羰基(醛基或酮基)反应生成-C=N。这一类方法根据衍生化试剂的不同可分为以下几种。 1.1.1 与烷基胺及芳香胺反应 Honda[1]等首次发现，还原糖与乙二胺在微碱性磷酸盐缓冲溶液中共热，产生强荧光，这一发现可用于还原糖的测定。该衍生化方法对大多数糖的检测限小于 1nmol。后来，Kato 和 Kinoshita[2]用乙醇胺和 2-氨基丙腈对糖衍生化，然后通过荧光进行测定。乙醇胺作为衍生化试剂时，线性范围为 0.3-5.4nmol。2-氨基丙腈作为衍生化试剂时，线性范围：葡萄糖 0.533-5.33nmol，木糖 0.27-5.33nmol。 与直链烷基胺相比，芳香胺类作为衍生化试剂应使糖的测定有较高的灵敏度。Umegae 等以不同的芳基取代乙二胺的两个碳上的氢，合成了一系列的乙二胺衍生物，他们称这一类衍生物为 1,2-二芳基乙二胺，简称 DAE。这些 DAE 中有 8 种可与糖共热产生荧光，其中内消旋-1,2-二(4-甲氧苯基)乙二胺是最好的荧光试剂[3]，对于不同的糖检测限为 0.2-0.9nmolml-1。 1.1.2 还原胺化衍生反应 还原胺化衍生反应的原理是：糖的还原端羰基(醛、酮)与含有伯氨基的芳香化合物作用，生成 Shiff 碱后被 NaBH3CN 还原为仲胺，然后通过紫外吸收或荧光予以检测。该衍生化的优点是：1)产物十分稳定，对强酸强碱均不反应；2)无副反应发生；3)既可利用荧光检测又可利用紫外吸收检测。检测限随衍生化试剂及检测方法的不同有较大变化。例如，用 8-氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)作为衍生化试剂[4]，紫外检测的检测限为 5×10- 7mol/L，用 5-carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester (TRSE)[5]衍生化并用激光诱导荧光检测，检测限可达 10-11mol/L。还原胺化反应被广泛应用于柱前衍生化，特别是用于毛细管电泳法的柱前衍生化。 1.1.3 与酰胺类化合物反应 酰胺类化合物是一种使用较早且应用较为广泛的糖的衍生化试剂。其中具有代表性的是 2-氰基乙酰胺，它与醛糖在弱碱性溶液中共热产生强荧光物质, 该反应适用于柱后衍生化，产物也可以用光度法检测，对醛糖检测限可达 0.1nmol[6]，利用该方法能够在低温下分辨异构体。最近，Honda 等提出用玻璃碳电极对该衍生产物进行检测[7]。这一衍生化法的优点在于：反应条件温和，检测灵敏度高，检测方法多样化。 1.1.4 与胍及其衍生物反应 胍具有两个-NH2，在硼酸盐存在下与糖反应生成咪唑环[8]，通过咪唑环的荧光可对糖进行检测。检测限为：戊糖 5pmol，己糖 6pmol。该反应比乙烯氨基衍生物与糖的反应容易，灵敏度高，空白小且重现性好。 与胍有类似结构的两个化合物——精氨酸和苯甲脒是糖类较好的荧光探针。精氨酸[9]衍生化条件温和，类似于 2-氰基乙酰胺和脂肪胺在硼酸介质中的反应。葡萄糖和果糖的荧光强度相近，葡萄糖检测限为 25pmol，蔗糖和棉子糖只给出相当于葡萄糖4%的荧光强度，而 2-脱氧糖则没有荧光。苯甲脒和它的对甲氧基衍生物作为衍生化试剂时，灵敏度较高，但反应需在强碱介质中进行[10]。 1.1.5 与吡唑啉酮反应 1-苯-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP),1-(对-甲氧基)苯-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMPMP)和还原糖在微酸性条件下进行缩合反应，生成双-PMP 和双-PMPMP 衍生物。这两种衍生化方法因为不损失唾液酸，所以对唾液化的寡聚糖特别有效。由于 PMPMP 的反应活性更高，因此它具有更高的灵敏度[11]。PMPMP 应用于 HPLC，而 PMP 近来被用于 CE 中。 1.1.6 酸性糖的衍生化反应 Mechref 和 EI Rassi 提出了酸性糖的衍生化方法[12]，其原理是：对氨基苯磺酸(SA)或 7-氨基萘-1,3-二磺酸(ANDSA)的氨基和酸性糖的羰基在水溶性碳化二亚胺(HN:C:NH)存在下缩合成一个肽链(如 scheme 1 所示)，利用 UV 检测。用 SA 和 ANDSA 进行衍生化，检测限分别为 2×10-5mol/L 和 1×10-5mol/L。
Scheme 1
1.1.7 与肼类试剂的衍生化反应 肼与醛缩合形成腙是一个经典反应，利用这一反应可进行还原糖的光度法测定。该方法由于衍生化效率高，因而有较高的灵敏度。Del Nozal 等报道用 4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑(Purpald)与还原糖缩合[13]，然后用光度法检测，检测限为 0.1mmol/L。 1.2 糖氨基的衍生化 氨基糖是一种基本的碳水化合物，它广泛存在于低聚糖和高聚糖中。由于氨基糖及糖胺是直链伯胺，具有胺的性质，所以可用氨基酸的检测方法进行检测。例如，在 2-巯基乙醇的存在下，己糖胺、己糖胺醇与邻苯二醛反应，产物可用反相 HPLC 分离并用荧光法检测[14]。反应几乎不受盐存在的影响，己糖的检测限可达 1.6pmol。 1.3 利用糖的还原性进行衍生化 1.3.1 IO4--Hantzsch 反应 IO4--Hantzsch 反应是利用糖的还原性进行衍生化的一类重要衍生化方法[15]。该方法先用高碘酸将糖氧化成甲醛，然后利用 Hantzsch 吡啶合成反应生成吡啶衍生物，反应机理如 scheme 2 所示。该方法既适用于光度法也适用于荧光方法检测，并且具有-CHOH-CH2OH 或-CO-CH2OH 基团的糖均可用该方法进行测定。利用荧光检测时其检测限为 0.5nmol。 1.3.2 金属离子作为氧化剂的反应 还原糖能被某些金属离子氧化，同时金属离子被还原，若还原后的金属离子能与某些化合物形成络合物，并且在可见-紫外光区有吸收，则可用光度法测定，若还原后的金属离子有荧光也可通过荧光进行测定。
Scheme 2
Xu Hanying[16]将糖与 K3[Fe(CN)6]于沸水中加热处理，用分光光度法测定样品中的总糖量，检测限为 0.05 mg/mL。此外，在 90°C 时还原糖能将 Cu(II)还原为 Cu(I)，而 Cu(I)与菲罗啉形成的络合物在 75 mV 下发生电化学反应，生成 Cu(II)，根据这一原理可以用电化学方法进行还原糖的检测[17],检测限达 1pmol。 1.4 转化成呋喃甲醛后与显色剂的缩合反应 这一类衍生化反应的原理是：单糖在强酸中脱水环化为糠醛衍生物，然后与显色剂进行缩合反应，并用光度法进行检测。但聚合糖和寡糖需先水解为单糖再进行衍生化。常用的显色剂有：苯酚，5-甲基-1,3- 苯二酚，蒽酮，半胱胺酸，咔唑，间苯二酚，吲哚，邻氨基苯硫酚，5-羟基-四氢萘酮等。利用这一原理，糖与某些显色剂反应能产生强荧光物质，因此也可用荧光检测[18]。这一方法的优点是既可分析还原糖又可分析非还原糖，缺点在于：反应必须使用强酸，而强酸腐蚀设备。 1.5 化学发光反应和酶反应 化学发光反应和酶反应也是糖的衍生化常用的方法。化学发光方法具有检测限低、线性关系好、仪器简单等特点，其缺点是缺乏选择性，但与酶反应相结合后选择性可大大提高。 1962 年，Clark 和 Lyons 首先报道了基于酶反应的电化学葡萄糖传感器。在葡萄糖氧化酶(GOD)的催化下，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和没有荧光的硫胺素在辣根过氧化酶(HRP)的催化下生成有荧光的硫胺荧。宫志龙等[19]利用该原理间接测定了血液中血糖的浓度，检测限为 0.15mg/L。H2O2 与二(2,4,6-三氯苯基)草酸盐能产生化学发光。利用这一性质 ，以 二(2,4,6-三氯苯基)草酸盐为底物，将葡萄糖氧化酶固定到表面膜上，能够测定葡萄糖的浓度[20]，该方法的检测限 6×10-7mol/L。通过合适的酶的作用，果糖，甘露糖，乳糖，及蔗糖都可以被转化为葡萄糖，从而进行测定，这使得酶催化检测技术的应用范围进一步扩大。此外，将葡萄糖氧化酶及乳酸氧化酶等多种酶同时植入固定化酶柱上，可以实现几种糖的同时检测。 1.6 其它衍生化方法 除以上所述衍生化技术之外，还有其它一些衍生化方法，例如 Kikutani[21]发现镧系离子中，Eu3+、Tb3+和 Dy3+与某些糖(如葡萄糖，木糖，半乳糖，果糖等)共热后其特征荧光可以增强，利用该效应可以测定 10 m mol-5mmol 的葡萄糖。 2 糖衍生化技术的应用 在实际测定中以上各种衍生化方法都得到了广泛应用，特别是将它们与色谱技术相结合之后，使得糖类的检测方法变得多样而有效。其在柱前衍生化及柱后衍生化中的应用分别列于表 1 和表 2。 柱前衍生化是指对糖类先进行衍生化，然后通过色谱技术进行分离并予以检测。建立在柱前衍生化的基础之上的分析系统被认为是高灵敏度糖类系统分析方法的最佳选择。它不仅适用于液相色谱而且适用于电泳分离方法。
表1——在柱前衍生化中的应用
衍 生 化 方 法 | 检测手段 | 分离方法 | 应用 | 参考文献
与胺 及类 胺化 合物 反应 | 还原胺化反应 |  |  |  |
8-aminonaphthalene-1,3,6- | P,F | GE、HPCE | 单糖，低聚糖， | 5
trisulfonic acid (ANTS) |  |  | 中性糖及氨基 |
N,N-(2,4-dinitrophenyl) octylamine (DNPO) | P | CZE，MEC | 糖 | 22
TRSE | F | CE |  | 6
与吡唑啉酮反应 |  |  |  |
PMP，PMPMP | P，E | HPLC | 还原糖 | 12
酸性糖衍生化反应 |  |  |  |
SA 及 ANDSA | F | CE | 酸性还原糖 | 13
与肼反应 |  |  |  |
9-fluorenylmethoxy-carbonyl (Fmoc) | F，P | HPLC | 还原糖 | 23
糖氨基 衍生化 | OPA | P | HPLC | 氨基糖 | 15
Note: | P: | photometry | CZE: | capillary zone electrophoresis
| F: | fluorimetry | MEC: | micellar electrokinetic chromatography
|  |  | HPCE: | high performance capillary electrophoresis
| CL: | chemiluminescence | GE: | gel electrophoresis
|  |  | SFC: | supercritical fluid chromatography
表2——在HPLC柱后衍生化中的应用
衍生化方法 | 检测手段 | 应用 | 参考文献
与胺 及类 胺化 合物 反应 | 与烷基胺反应 |  |  |
乙二胺 | F |  | 1
2-乙醇胺 | F | 还原性单糖及低 | 3
DAE | F | 聚糖 | 4
与酰胺反应 |  |  |
2-Cyanoacetamide | P,F,E |  | 7, 8
与胍的衍生物反应 |  |  |
Arginine | F |  | 10
Benzamidines | F |  | 11
与肼反应 |  |  |
Purpald | P |  | 14
氨基糖 衍生化 | 邻苯二醛 | F | 氨基糖 | 24
利用还 原性反应 | Cu2+-bis(phenanthroline) | E | 几乎所有的单糖 | 18
高碘酸氧化然后 Hantzsch 反应 | P,F | 低聚糖 | 16
转化成糠 醛后与显 色剂反应 | O-aminothiophenol--H2SO4 | F | 醛糖 ,酮糖 氨基糖,低聚糖 | 19
化学发光 及酶反应 | GOD 催化氧化后化学发光反应 | CL | 葡萄糖 | 25
柱后衍生化是指先将糖类通过色谱技术进行分离，然后衍生化并加以检测。柱后衍生化法适用于液相色谱，因为液相色谱可以通过控制反应器的体积大小、流动相流速以及浴温等手段，来实现一定的反应温度及在该温度下所需要的时间。相比之下电泳法无法提供足够的反应时间，因而柱后衍生化不适用于电泳法。 3 展望 糖类的研究有着巨大的应用前景，并且必将对人类的生活产生深远的影响，而包含衍生化技术在内的糖类分析作为研究的必要前提，有着巨大的发展潜力。 今后，糖类的衍生化技术将沿着高灵敏度、快速测定及高选择性的方向发展。由于毛细管电泳具有很好的分离效果，而荧光方法具有很高的灵敏度，所以可以预计适合于毛细管电泳分离并可用荧光方法检测的衍生化方法将是具有很大发展前景的衍生化方法。由于当前所采用的衍生化方法反应条件较苛刻反应速度较慢，因此寻找反应条件温和、反应速度快的衍生化方法将成为一个研究热点。而寻找具有分子识别功能又具有检测功能的衍生化试剂，将会成为糖类衍生化技术的重要研究课题。 4 参考文献 [1] Honda S, Kamimoto K., Sudo K., Kakehi K., Takiura K., Anal. Chim. Acta, 1974, 70: 133 [2] Kato T, Kinosita T, Chem. Pharm. Bull., 1978, 26:1291 [3] Umegae Y, Anal. Sci., 1989, 5: 371 [4] Stefansson M and Novotny M, Anal. Chem.,1994, 66:1134. [5] Zhao J Y, Dovichi N J, Hindsgaul O,etc, Glycobiology, 1994,4:239 [6] Honda S, Takahashi M, Nishimura Y, etc, Anal. Biochem., 1981, 118:162 [7] Honda S, J. Chromatogr. A. 1996,720:183-199 [8] Yamauchi S., Nimure N, Kinoshita T, etc, Analyst, 1993, 118(7) :773-776 [9] Mikami H, Ishida Y, Bunseki Kagaku, 1983, 32:E207 [10] Coquet A, Enthey V J L, Haerdi W, J. Chromatogr., 1991, 553(1-2): 255-263 [11] Kakehi K, Shigeo S, Honda S,etc, Anal. Biochem. 1991,199(2):256-268 [12] Mechref Y and Rassi Z El, Electrophoresis, 1994, 15:627 [13] Nozal M J D, Bernal J L, Hernandez V, etc, J. Liq.Chromatogr., 1993,16:1105 [14] Altmann F, Anal. Biochem. 1992, 204:215 [15] Samuelson O and Stromberg H, Carbohydr. Res., , 1966, 3:89 [16] Xu Hanying, 吉林大学自然科学学报 1996, (4): 98-100 [17] Watanabe N., Inoue M., Anal. Chem., 1983, 55: 1016 [18] Nakano S, Taniguchi H, Furuhashi T, et al. Yakugaku Zasshi, 1993, 93:350 [19] 宫志龙，章竹君，张海，分析化学，1996,24(9):998-1001 [20] Abdel-Latif M S, Guilbault G, Anal. Chem., 1988, 60: 2671-4 [21] Kikutani N, Ichikawa H, Tomomastsu T, Nakamura H, Anal. Sci.,1995, 11(5): 843-4 [22] Zhang Y. Cedergren R A, Nieuwenhuis T J and Hollingsworth R I, Anal. Biochem.,1993,208:363. [23] Zhang Renen, Zhang Zhidan, Lin Guoquan, Hidaka Yuji, etc, J. Chromatogr. 1993, 646(1):45-52. [24] Perini F and Peters B P, Anal. Biochem., 1982,123:357 [25] Koerner P J and Nieman T A, J. Chromatogr. 1988, 449:217-228 黄方 男, 27 岁，山东大学化学院硕士研究生。 **通讯联系人。 由省和国家自然科学基金以及国家教育部材料和生命过程分析科学开放实验室(厦门大学)资助。