The Ester Synthesis Catalyzed by Lipase in an Aqueous System Hu Xiaoyan, Song Xin, Wei Liumei, Qu Yinbo (The state key laboratory of Microbial Technology,Shandong University, Jinan 250100) Abstract The mechanism of the ester synthesis in the aqueous phase was inquired in some degree by the study of ester hydrolysis inhibited by various alcohols.On the other hand,the affect of different conditions on the ester synthesis were studied and an ideal output of the ester was obtained. Key words Lipase, Aqueous phase, Ester synthesis, Methand, Oleicacid 摘要 本文通过研究不同种类的醇对于微生物脂肪酶催化的酯水解反应的抑制作用，对水相中酯合成反应的机制进行了初步的探讨，并对微生物脂肪酶催化的油酸和甲醇的酯合成反应进行了条件优化，使其酯合成效率达到了较为理想的水平。 关键词 脂肪酶 水相 酯合成 甲醇 油酸 利用脂肪酶催化水相中酯合成反应的研究 胡晓燕 宋欣 魏留梅 曲音波 (山东大学微生物技术国家重点实验室 济南　250100) 酯合成反应和酯水解反应是由脂肪酶催化的一对可逆反应，因为水使平衡向水解方向移动，因此在水相中进行的酯合成反应往往效率较低，所以十几年来，对酯合成反应的研究一直集中在有机相中酯合成反应的研究上[1,2]。虽然有大量研究认为有机溶剂的存在是有利的，例如在控制水活度和防止微生物污染方面，但无溶剂存在时，脂肪酶催化的酯合成和醇解反应对于工业应用来说也非常重要。比如在食品应用方面，无溶剂系统因为没有有机溶剂的存在，因此产物的后处理过程简单，而且安全性提高[3]。此外，研究发现不同种类的醇对于水解反应都有一定的抑制作用，因而在一定程度上可促进酯合成反应的进行。而且对于某些醇来说，水相中酯合成反应的效率较高，因而有一定的应用价值。 1 材料与方法 1.1试剂 甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，戊醇，己醇，庚醇，以及油酸，以上试剂均为分析纯。 1.2 脂肪酶水解活力测定 按照Yamada等的橄榄油底物乳化法进行测定[1]。在30°C，pH8.0对橄榄油乳化液水解反应10min，以每分钟产生1 m mol脂肪酸所需的酶量定义为一个单位(U)。 1.3 酯合成程度的测定 用丙酮-乙醇混合液终止反应，然后用酚酞甲醇溶液作指示剂，用0.01mol/L NaOH甲醇溶液滴定。将所得的NaOH消耗量转化成油酸消耗量，进而计算酯合成百分率。 2 醇对水解的抑制作用 2.1 不同浓度甲醇对水解的抑制作用 反应系统为：4mL橄榄油乳化液，5mL磷酸缓冲液(pH7.0)，15mgCCL酶粉 ，不同体积的甲醇，30°C振荡反应10min后，用10mL乙醇终止反应，然后用0.01mol/L NaOH甲醇溶液滴定。对照反应结束，再加入相同量的甲醇。 结果表明在低浓度时，甲醇对脂肪酶的水解作用有利，而在较高浓度时，便表现出对水解的抑制作用，当甲醇量为5mL时，其抑制作用已非常明显。因而，当以甲醇为底物进行酯合成反应时，较高的浓度不仅有利于酯合成反应的进行，而且由于甲醇对水解的抑制作用，进一步提高了酯合成效率。 2.2 其它醇对水解的抑制作用与其酯合成效率的关系 2.2.1 反应系统： (1) 酯合成反应系统：0.014mmol各类醇，1g油酸，150mgCCL酶粉，1.5mL磷酸缓冲液(pH 7.0)，30°C振荡反应48h，用丙酮-乙醇萃取后，用0.01mol/L NaOH甲醇溶液滴定。 (2) 水解抑制反应系统：0.014mmol各类醇，4mL橄榄油乳化液，5mL磷酸缓冲液(pH 8.0),20mgCCL酶粉，30°C振荡反应10min，用10mL乙醇终止反应，然后用0.05mol/L NaOH溶液滴定。 2.2.2 结果与讨论
醇 | 溶解性 | 酯化率/% | 抑制效率/%
甲醇 | 易溶 | 81.7 | -3.1
乙醇 | 易溶 | 42.4 | -6.7
丙醇 | 易溶 | 19.1 | -42
丁醇 | 微溶 | 27.9 | 92.4
己醇 | 微溶 | 62.7 | 81.9
辛醇 | 不溶 | 43.2 | 71.8
癸醇 | 不溶 | 22.7 | 67.2
(1) 从上表中可看出，甲醇，乙醇和丙醇对水解都有一定的促进作用，而且促进作用越大，酯化率越低，这是因为酯合成反应和水解反应是可逆反应，因此促进水解的进行必然导致酯合成效率的降低。而丁醇、己醇、辛醇和癸醇对水解都有一定的抑制作用，且抑制作用随分子量增加而减弱，而抑制作用与酯合成效率之间却无明显的正比关系，说明酯合成效率不仅与醇的抑制作用有关，而且可能存在其他的影响因素。而且与易溶性的醇相比，它们有一个共同特征，即在水解反应结束后，发现有油脂出现，分析可能是因为醇将油脂从乳化液中置换出来，导致底物减少，从而使水解反应减弱，那是否对于丁醇等醇来说，也存在象甲醇一样的现象(见图1)。为进一步分析原因，设计以下实验。 图1 甲醇对酯水解的抑制作用 (2) 不同体积的丁醇对水解反应的影响 反应系统：不同体积的丁醇，4mL橄榄油乳化液，1g油酸，150mgCCL酶粉，5mL磷酸缓冲液(pH7.0)，30°C振荡反应10min，然后丙酮-乙醇萃取，用0.01mol/L NaOH溶液滴定。 结果表明，丁醇浓度对水解的抑制作用影响很大，存在与甲醇同样的现象，在低浓度时，有促进作用，当其浓度为0.2mL时，即开始有抑制作用。说明丁醇对水解的抑制作用不是因为其将油脂置换出来，而是可能有其它的原因存在。
| 图2 丁醇对酯水解的抑制 | 图3 丙醇对酯水解的抑制
(3) 不同体积的丙醇对水解反应的影响 反应系统：不同体积的丙醇，4mL橄榄油乳化液，1g油酸，150mgCCL酶粉，5mL磷酸缓冲液(pH7.0)，30°C振荡反应10min，然后丙酮-乙醇萃取，用0.01mol/L NaOH溶液滴定。 结果表明，丙醇也存在与甲醇和丁醇同样的现象，至于为何有这样一个最优点，机制尚不清楚，有待于进一步的探讨。 3 油酸和甲醇酯合成反应的条件优化 3.1 不同水含量对酯合成反应的影响
| 图4 水含量对酯合成反应的影响 | 图5 甲醇油酸比对酯合成的影响
反应系统：5mL甲醇，1g油酸，150mg脂肪酶，30°C振荡反应24h。 由上图可知，水含量为50%时，酯合成效率最高。而当水含量继续增加时，酯合成效率下降。说明水含量和酯合成效率并不成线性关系。分析原因，主要是因为甲醇溶于水，油酸不溶于水，酶在油水界面上起作用，在一定水含量范围内，随着水量增加，酶的可溶性增加，酯合成效率增加，但当水含量过高时，由于水解反应加剧，甲醇的浓度过低，其对水解反应的抑制作用减少，因而，酯合成效率降低。 3.2 不同甲醇油酸比对酯合成反应的影响 反应系统：1g油酸(接近0.14mL)，不同体积的甲醇,50%水含量，30°C振荡反应24h 由上图可知，在一定的底物浓度范围内,随着甲醇量增加,酯合成效率增加，当体积比大于4时，酯合成效率开始降低。分析原因，主要是因为随甲醇量增加，对水解的抑制作用增加，因而酯合成效率增加。而甲醇量过高时，会使酶变性，并对活力有动力学影响。底物的抑制作用导致酯合成效率下降。 3.3 不同的脂肪酶量对酯合成反应的影响 反应系统:1g油酸，0.56mL甲醇，1.56mL水，30°C振荡反应24h 结果表明，酯合成效率与脂肪酶量成正比。
| 图6 酶量对酯合成反应的影响 | 图7 酯合成反应的最适转速
3.4 不同转速对酯合成反应的影响 反应系统: 1g油酸，0.56mL甲醇，1.56mL水，150mg脂肪酶，30°C振荡反应24h。 结果表明，转速越高，酯合成效率越高[6]。因为转速越高，反应越充分，酶与底物的作用越好。 3.5 不同pH对酯合成反应的影响 反应系统: 1g油酸，0.56mL甲醇，1.56mL水，150mg脂肪酶，不同pH磷酸缓冲液3mL，30°C振荡反应24h
| 图9 酯合成反应的最适pH
由上图可知，不同的pH对反应有一定影响，pH 6.5时反应效率最高,而该酶的最适水解pH 8，说明脂肪酶的水解活力和其酯合成活力无必然联系。 3.6 同样酶量的不同酶样对酯合成反应的影响 反应系统:1g油酸，0.56mL甲醇，1.56mL磷酸缓冲液(pH 6.5)，150mg脂肪酶，30°C振荡反应24h。
菌株名称 | 脂肪酶活/u.ml-1 | 酯合成效率/%
S9 | 14.2 | 34%
J8-2 | 7.6 | 43%
M2 | 5.8 | 23%
CCL | 18 | 67%
YU | 28 | 59%
JII | 9.7 | 35%
结果表明，脂肪酶水解活力与其酯合成能力并无必然联系。 4 讨论 曾有文献报道，甲醇对酯水解有一定的抑制作用，但对于水解的机制却很少有人进行进一步的研究。研究中发现，除了甲醇，其它的醇类如丙醇，丁醇等也具有与甲醇类似的现象。而且不同浓度的甲醇对酯合成有不同的作用。在低浓度时对水解有促进作用，而当超过某一临界浓度后，开始对水解有抑制作用。在其它醇中，如丙醇和丁醇的研究中也得到了同样的结果，而且发现不同醇的临界浓度不同。因而推测在醇的浓度较低时，酯合成反应因为底物浓度低而效率很低，而在高浓度时，甲醇作为底物一方面促进了酯合成反应的进行，另一方面作为产物抑制了水解反应的进行，因而酯合成效率较高。此外，对甲醇和油酸的酯合成反应条件进行了优化，得到了较为理想的酯合成效率。 注：(1)CCL脂肪酶是一种由假丝酵母产生的已商品化的脂肪酶；(2)因为在研究中所使用的醇均为液体，所以对同一种醇来说，体积与其摩尔数是一致的。而且因为醇在整个反应体系中占的体积很小，所以其体积可代表其摩尔浓度。而在文中出现浓度一词，主要是为了理解方便和习惯而已。 5 参考文献 [1] Lee L L et al. J.Org.Chem. 1986,51:25. [2] Linko YY et al. J.Am.Oil.Chem.Soc. 1994,71:1411. [3] Ishii A P et al. Ester synthesis by a crude lipids of Rhizopus sprus in an aqueous system,J.Ferm.Bioeng. 1990,70:188. [4] 张苓花，王运吉. 高产脂肪酶菌株的诱变筛选. 生物技术，1996，6(2):20. [5] Khmelnitsky Y et al. Engineering biocatalytic systems in organic media with low water content, Enzyme Microb.Technol.1988,10:710. [6] Koshiro S et al. Stereo-selective esterfication of dl-methal by polyurethane-entrapped lipase in organic solvent, J. Biotechnol., 1985, 2:47. 胡晓燕 女，25岁，博士生，从事微生物脂肪酶应用及神经系统特异表达基因功能的研究。 1999-10-19收稿，2000-05-08修回。