The study of anti-oxidation of red ginseng、shengshai ginseng、American ginseng and the protective effect on DNA with chemiluminescence Fang Rongmei, He Pingang, Li Xiaojun, Fang Yuzhi (Department of Chemistry, East China Normal Univeristy, Shanghai 200062) Abstract In this paper, we've studied the protective effects of three kinds of ginseng(red ginseng、shengshai ginseng and American ginseng) on DNA against the oxidative damage in CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA chemiluminescence mixture. We find that the protective effect of red ginseng's extract is the best. The protective effect of shengshai ginseng is better than that of American ginseng.The reason is that the amount of effective component(sancun zaodai) in ginseng(including red ginseng and shengshai ginseng) is larger than that in American ginseng, and because of different process, new antioxidants such as maltol and salicylaldehyde are formed in red ginseng. Key words DNA damage, Chemiluminescence, Red ginseng, Shengshai ginseng, American ginseng 摘要 利用CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化学发光体系研究了红参、生晒参、西洋参对DNA氧化损伤的保护作用。通过实验发现，对DNA的保护作用为红参优于生晒参、生晒参优于西洋参。因为人参(红参和生晒参)所含的有效成分三醇皂甙的量比西洋参多,而红参由于加工过程不同，产生新的抗氧化剂如maltol和水杨醛。 关键词 DNA损伤 化学发光 红参 生晒参 西洋参 化学发光法研究三种参对 DNA 损伤的保护作用* 方荣美 何品刚 李晓军 方禹之** (华东师范大学化学系 上海 200062) DNA 是生物体内一种重要的大分子,它的氧化损伤在癌症、衰老等疾病的发生过程中起着重要作用。.OH 一直被认为是引起 DNA 损伤的重要因素。生命体内的.OH 可通过抽提核酸分子中碱基氢或戊糖氢，从而引起 DNA 碱基发生开环、脱落等变化，使 DNA 双螺旋间的氢键遭到破坏，DNA 发生单链或双链断链、交联等作用[1]。虽然活性自由基除.OH 外还有.O2-，一般认为.O2-对 DNA 等生物分子的损伤是由于它与 H2O2 作用形成中间产物·OH 引起[2]。因此，研究抑制.OH 对 DNA 损伤的药物有重要意义。 用于清除自由基的抗氧化剂种类很多,但是近年来,从天然物质中筛选高效、无毒的自由基清除剂成为生命医学的一个研究热点。参是非常好的抗氧化剂, 在参类中有人参和西洋参两大类。人参中又分红参和生晒参，二者区别在于加工方法不同：直接晒干名生晒参；蒸熟后晒干名红参。人参中抗衰老的生物活性物质虽然因作用而异，可主要是人参皂甙。但是,关于参对 DNA 的氧化损伤的保护作用的研究尚未见文献报道。 用化学发光法研究药物对 DNA 损伤的保护作用是一方便可靠的方法,已有不少报道。本实验利用 CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA 化学发光体系[3]研究红参、生晒参、西洋参提取液对 DNA 受·OH 损伤的抑制作用。实验证明，这些提取液都能有效地清除.OH，抑制 DNA 受.OH 的损伤。并且实验发现对 DNA 损伤的保护作用效果分别为红参优于生晒参，生晒参好于西洋参。 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 硫酸铜(分析纯,上海振兴试剂厂)；邻菲罗啉(Phen,分析纯,上海试剂三厂)；维生素 C(VC,分析纯,第二军医大学卫辉试剂厂)；过氧化氢(30%,分析纯,上海桃浦化工厂)。鱼精DNA(生化试剂,中国科学院上海生物化学研究所)；LKB-1250 化学发光仪(1250Luminometer,样品池可恒温)。 1.2 参中有效成分的提取 红参、生晒参、西洋参的有效成分提取液的处理方法: 将市售红参、生晒参、西洋参在 80°C 烘箱中烘 3h,分别称取 1.4900g 烘干的红参、生晒参、西洋参置于 3 个 50mL 的烧杯中,加入 15mL 的 2 次蒸馏水,在 100°C 水浴锅中加热 2h,蒸发到 5mL 以下,再过滤提取液,在 10.0mL 容量瓶中定容。 1.3 测试方法 在 10.0mL 容量瓶中用 0.1mol/L 醋酸缓冲溶液(PH5.5)配制 CuSO4-Phen-Vc 溶液，使 Cu2+、Phen、Vc 终浓度分别为 3.0×10-5mol/L、2.0×10-4mol/L、2.0×10-4mol/L，加入一定量的DNA和各种提取液，最后定容。取该溶液0.65mL放入发光仪样品池中，加入 400 m L3.0％的 H2O2 溶液，立即测量化学发光反应动力学曲线。 2 结果与讨论 2.1 DNA 浓度、H2O2 浓度及测量温度、pH 值对化学发光的影响 据文献[3]报道,在 CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA 化学发光体系中生成.OH，.OH 损伤 DNA，产生一晚于 Phen 本身氧化发光信号的慢化学发光，其发光强度与 DNA 损伤程度有关，损伤越严重，发光强度越强。DNA 受损伤的发光强度在一定范围内随 DNA 量的增加而增加[4]。为得到最佳实验效果，本实验选用 DNA 终浓度为 0.62 m g/mL。 同时，CuSO4-Phen-Vc-H2O2 体系的发光强度随 H2O2 浓度的加大而增强，但当 H2O2 浓度过大时，发光强度趋于饱和，因此本实验选用 H2O2 终浓度为 1.2mol/L。 测量温度对反应也有很大影响，温度越高，反应速度越快，发光峰出现越早，但峰高降低。这是由于温度升高使得反应生成的激发态发光物质发生无辐射跃迁的几率加大，很大一部分能量以热能形式散失到环境溶液中去，从而发光强度降低。本实验的测量温度选择为 25± 0.5°C。 基底液的介质和酸度对体系的发光强度也有很大影响。溶液酸性越大，反应速度越慢，发光峰出现越晚，峰值越小；溶液越接近中性，反应速度越快，发光峰出现越早，峰值越大，但不易记录；溶液离子强度越大，发光峰越强。综合考虑,本体系用 pH＝5.5 的 0.1 mol/L HAC-NaAC 缓冲溶液最合适。 2.2 3 种参提取液对 DNA 保护作用的比较
| 图
1 3 种参提取液对 DNA 损伤发光的保护作用 a CuSO4-Phen-Vc-H2O2; b a+DNA; c b+红参提取液; d b+生晒参提取液; e b+西洋参提取液 |  | 图2 3 种参提取液对基底液损伤发光的保护作用 a CuSO4-Phen-Vc-H2O2; b a+红参提取液; c a+生晒参提取液; d a+西洋参提取液

如图1所示，在DNA存在下，产生一明显延迟于基底反应峰的发光峰，且发光峰强度显著增加。由于.OH对DNA的损伤严重，DNA的损伤发光较强。因此，DNA的损伤发光峰几乎掩盖了Phen的发光峰(见图1的a、b)。
当在体系中分别加入三种不同的人参提取液后，使DNA损伤引起的发光峰的强度明显减小(见图1c、d、e)，且发光时间延长，表明对DNA损伤有明显的抑制作用。另一方面,当在基底液(CuSO4-Phen-Vc-H2O2)体系中加入3种参提取液,由图2 b、c、d显示,3种参提取液也能够抑制Phen的发光。由此证明，提取液对CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA发光体系从两个方面起作用，一方面清除.OH自由基，保护DNA免受损伤，从而抑制DNA发光物的生成；另一方面抑制Phen发光物的生成。 因此，对在相同的参提取液存在下的DNA发光曲线(图1 c、d、e)分别进行积分，求得1000s内的发光积分值，减去在基底反应液中同样的参提取液存在下的发光曲线(图2 b、c、d)同时间内的发光积分值，即为参提取液存在下的DNA损伤发光值。表1列出了红参、生晒参、西洋参提取液存在下的DNA损伤发光值, 从表中可知，红参存在下DNA损伤发光值最小，生晒参次之，西洋参最大。换而言之,由所得数据说明，对DNA损伤起保护作用的效果分别为红参优于生晒参，生晒参优于西洋参。

表 1 红参、生晒参、西洋参提取液存在下的 DNA 损伤发光值
不同的参提取液 | 红参 | 生晒参 | 西洋参
DNA 损伤发光/mV.s | 716. 7 | 1557. 1 | 2210. 6
积分时间：1000s

3 结论
通过实验证明参提取液对 DNA 氧化损伤所引起的化学发光有明显的抑制作用。而其抑制作用为 红参优于生晒参，生晒参优于西洋参。这是因为在参中起到抗氧化作用的活性物质虽然不只一种，但主要是人参皂甙，而人参皂甙的甙元主要分为原人参二醇和原人参三醇 , 人参三醇型皂甙比人参二醇型皂甙生理活性强。据文献[5]报道人参(红参和生晒参)中所含三醇皂甙的量比西洋参所含三醇皂甙的量高得多。另一方面,对于红参，在加工过程中皂甙成分之间发生转化，产生诸如 maltol 等新的抗氧化剂和水杨醛等生理活性更强的化合物[6-8]。因此，抗氧化能力分别是红参优于生晒参，生晒参优于西洋参。
4 参考文献
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方荣美 35 岁，女，讲师，主要从事分析化学研究。**联系人 国家自然科学基金资助课题(29875008)