The Effect of Structure-changed Water on Heat Stability of Lysozyme Zhao Lin, Tan Xin (School of Chemical Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072) Abstract The results obtained by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the thermal denaturation temperature of lysozyme had been elevated 8.47K through hydration of lysozyme with processed water which structure had been changed so called "structured water" compared to ordinary water. The reason was that structure water changed dipole moment of water molecules and interacting force of maintaining three-dimensional conformation of lysozyme had been reinforced. Key words Lysozyme, Heat stability, Structured water, Water molecule clusters 摘要 经DSC实验证明：采用经处理后分子结构有改变的水(结构水)水合的溶菌酶，其变性温度比普通水高8.47K；主要原因在于结构水改变了水分子的偶极矩，加强了维持溶菌酶三维构象的作用力。 关键词 溶菌酶 热稳定性 结构水 水分子簇 水的微观结构改变对溶菌酶热稳定性的影响 赵林 谭欣 (天津大学化工学院 天津 300072) 水合作用对溶菌酶等生物大分子热稳定性的影响已被众多的学者所研究 。研究表明水合值的大小及其形成“结合水”多少直接影响溶菌酶的热稳定性[1-7]；同时也证明了差示扫描量热法(DSC)是一种可靠有效的研究生物大分子结构及其热稳定性的方法[1-8]。本文采用DSC方法研究了水的微观结构改变对溶菌酶热稳定性的影响。 1 材料及实验方法 1.1 材料 鸡蛋白溶菌酶来自SIGMA化学公司，三次结晶(Lot 35H9422)，分子量为14300； 1.2 实验用水 普通水为三蒸水；结构水：用三蒸水经低温冷冻和超声定频谐振制备而成。 1.3 仪器 差示量热仪采用日本岛津公司的DSC-50Q快速冷却差示扫描量热仪(测温范围为-150～725°C，灵敏度为0.03ｍJ.s-1)及由瑞士OHAUS公司生产的AP250D型天平(感量为十万分之一)。
| 图1 溶菌酶的DSC曲线 1 结构水水合溶菌酶；2 普通水水合溶菌酶；3 原溶菌酶
1.4 样品制备及测试方法 称取溶菌酶3～4mg，放入三个样品盘内，分别用不同的水对其进行水合密封。然后以-10～160°C的温度范围用DSC-50Q测样品的热谱图(结果见图1)。其中1号样为结构水水合样品，2号样为普通水水合样，3号样为原状溶菌酶(作为1号样参比)，升温速率为5K/min；测试后求出变性温度(Td)、焓变(△H)、水合值及结合水量。 2 结果讨论 由图1中看出：由结构水水合样品的变性温度为351.57K，比用普通水水合样品的变性温度(343.1K)高出约8.47K，比文献[6]中相同水合值时溶菌酶的变性温度(342K)高出约9.57K，说明结构水对溶菌酶热稳定性起到了增强作用。这种增强作用主要是结构水改变了溶菌酶中结合水的含量和结构。
表1 实验用水的熔解热及介电常数
| 熔融热/(kJ.mol-1) | 介电常数
普通水 | 6.05 | 78.25
结构水 | 8.22 | ９5.34
研究表明象溶菌酶这类蛋白质，其三维立体结构主要是由多肽链借助于各种次级键盘绕成具有特定走向的紧密球状结构，维持这种结构的作用力主要是氢键力、范德华力、疏水作用力和盐键力。结构水物化特性的改变(见表1)有助于上述作用力的加强。结构水物化特性的改变，其实质是由水分子电偶极矩的改变所致。就其孤立单体水分子而言，其偶极矩为1.855D，但在冷凝相中，由于周围水分子诱导产生的电场作用使单体水分子强烈极化，因此在冷凝相中单体水分子的偶极矩数值增加到了2.4～2.6D，比孤立单体水分子的偶极矩数值增加约40%，而经过低温冷冻后，其偶极矩值还会增加[9]。偶极矩的增大导致水的介电常数的增加(见表1)。电偶极矩的增加加强了溶菌酶分子表面电荷与偶极水分子之间的相互作用，在其周围形成了排列有序的结合水水化层，表2为样品状态参数及DSC测量结果，表中看出结构水水合溶菌酶时结合水量增加；每个溶菌酶分子周围的结合水分子数较普通水的分子数的258个增加了150个，达到408个，相当于溶菌酶中每个极性氨基酸残基对应约6个水分子，这些水分子在溶菌酶分子周围往往形成六角笼形的动态氢键网络，这种六笼形结构具有最为稳定的结构能[10]；而结构水中的水分子簇结构又以六环形和六笼形为主，由于水具有结构记忆功能[11]，因此，这种水在水合溶菌酶的过程中易于在其周围形成稳定的六环或六笼形结合水结构，从而加强了维持溶菌酶等蛋白质三维结构的作用力，因此，溶菌酶的热稳定性增强。
表2　样品状态参数及DSC测量结果
样品号 | 样品干重/mg | 水合值/(g.g-1) | Td/K | △H/(kJ.mol-1) | 结合水量/(g.g-1)
1 | 3.2 | 0.54 | 351.57 | 425.16 | 0.513
2 | 3.2 | 0.535 | 343.1 | 294.18 | 0.325
3 参考文献 [1] Fujita Y, Noda Y. Effect of hydration on the thermal denaturation of lysozyme as measured by differential scanning calorimetry. Bull.Chem. Soc. Jpn.,1978,51: 1567-1568. [2] Fujita Y, Noda Y. The effect of hydration on the thermal stability of ovalbumin as measured by means of differential scanning calorimetry. Bull.Chem. Soc.Jpn.,1981,54: 3233-3234. [3] Privalov P L. Heat capacity studies in biology， Biological Microcalorimetry. London: Academic Press, 1980:414. [4] Careri G,Gratton E, Yang P-H, et al. Correlation of IR spectroscopic, heat capacity, diamagnetic susceptibility and enzmatic measurements on lysozyme powder.1980,Nature, 284:572-573. [5] Finney J L,Goodfellow M J, Poole P L. Structural Molecular Biology. New York: Plenum press,1982 :387. [6] 傅亚珍.用差示扫描量热计对低含水量蛋白质热变性的研究.中国科学，1984(12)：1109-1102. [7] 傅亚珍. 水合作用对溶菌酶热稳定性的影响. 科学通报，1985(6)：456-459. [8] 刘云娜，韩布兴，谈夫. 碳酸酶构象变化的热力学研究. 科学通报，1998，43(15)：1628-1630. [9] Gergory J K, Clary D C, Liu K et al. The water dipole moment in water clusters, Science, 1997,275:814-817. [10] Liu K, Brown M G, Cater C et al. Characterization of a cage form of the water hexamer. Nature,1996,381: 501-503. [11] Clausse D, Babin L, Broto F et al.　Kinetics of ice nucleation in aqueous emulsions. J. Phys. Chem.1988,87:4030-4034. 赵林 男，39岁，副教授，博士，从事水的结构及其功能研究。 天津市自然科学基金(983606011)和中国博士后基金(中博基[1997]11号)资助项目。