New Development on Research and Application of Microbial Epoxide Hydrolases Tang Yanfa, Xu Jianhe, Ye Qin (The State Key Laboratory of Bireactor Engineering, Shanghai 200237) Abstract Enantiopure epoxides, as well as their corresponding vicinal diols, are highly valuable chiral synthons useful for the synthesis of various biologically active molecules. One of the presently emerging approaches is the use of the enantioselective hydrolysis of racemic epoxides using epoxide hydrolases (EHs). In this context, major characteristics, substrate specificities and enantioselectivities of epoxide hydrolases from various microbial sources, such as bacteria and fungi, are described. Key words Epoxide hydrolase, Chiral epoxide, Chiral vicinal diol, Biotransformation, Optical resolution 摘要 手性环氧化物及邻二醇是一些生物活性物质不对称合成中的重要中间体。应用细菌和真菌产生的环氧化物水解酶不对称水解消旋环氧化物来制备这些物质已引起人们的高度重视。此文对此进行了综述，并对它们的对映选择性进行了评价。 关键词 环氧化物水解酶 手性环氧化物 手性邻二醇 生物转化 光学拆分 微生物环氧化物水解酶的研究与应用新进展 唐燕发 许建和 叶勤 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237) 手性环氧化物及其开环产物邻二醇能与各种亲核试剂反应，因而在手性化合物的合成过程中被广泛应用，是一种重要的有价值的中间体。近年来很多研究小组都对它们的生产方法进行了研究[1]，如烯烃的 Katsuki-Sharpless 不对称环氧化和不对称二羟基化；烯烃的 Jacobsen 不对称环氧化。另一方面很多利用生物催化合成这类物质的方法已有报道，如水解酶类(特别是脂肪酶和酯酶), a-卤酸脱卤素酶，乳酸脱氢酶或甘油脱氢酶，单加氧酶，过氧化物酶和卤过氧化物酶。以上各种方法有的对底物有特殊要求，有的对映选择性不高，有的需要氧化还原辅酶如 NAD(P)H，这些都限制了它们的应用。不依赖于辅因子的环氧化物水解酶[EC.3.3.2.X]可以有效地代替以上各种方法，环氧化物水解酶最初是在哺乳动物肝组织的解毒功能研究中被发现，但由于从哺乳动物中得到的这种酶来源有限，故限制了其大规模应用，但近年来发现在一些微生物如细菌、真菌中也存在环氧化物水解酶，有效地解决了这一问题。本文将综述各类细菌和真菌产生的环氧化物水解酶。 1 环氧化物水解酶作用机理 酶的一个天冬氨酸残基进攻被酶的一个赖氨酸残基部分质子化的环氧化物的一端形成一个共价结合的二元醇单酯-酶中间体[2,3]，酶的组氨酸残基[4]从落到酶活性中的一个水分子中夺取一质子从而产生一个羟基，这个羟基进攻二醇-单酯-酶中间体，水解产生二醇，如图 1。 图 1 环氧化物水解酶的作用机理 图 2 环氧化物微生物水解时构型保持和构型反转 水解时有两个不同的途径，如图 2。 (1) 羟基进攻取代较少的碳原子，手性中心构型不变(如 by Asper- gillus niger)[5]。 (2) 羟基进攻取代较多的碳原子(即手性中心)从而使手性中心构型反转(如 by B. sulfurescens)[5]。 在两种途径中，进入的羟基都是以反式立体方式进入的，若环氧环的两碳原子都是手性碳，则羟基进攻的任何位置碳原子的构型都将反转。虽然保持构型不变的第一种方式较普遍，但也有一些构型反转的例子已报道[5-7]。 2 细菌产生的环氧化物水解酶 早期美国 Illinois 大学等小组发现 Pseudomonad sp. NRRL 2944[8]、Psedomonas pautida[9]、Bacillus megaterium ATCC 14581[10]中存在环氧化物水解酶，但真正开始对环氧化物水解酶的研究是由奥地利的 K. Faber 研究小组进行的。他们最初在用 Rhodococcus sp. NOVO 409 的固定化酶水解腈化合物的研究中发现该酶具有未知的能水解环氧化物的活性。对 1,1-二取代环氧化物，当 R1 为甲基，R2 为一长碳链时，对映选择性最高，剩余 R-环氧化物和水解产物 S-二醇 ee 值分别为 72%和 40%；对单取代环氧化物，ee 值都很低；而内消旋环氧化物则不能作为底物[11]，如图 3。 图 3 Rhodococcus sp. NOVO 409 不对称水解 1,1-二取代环氧化物 之后他们[12]筛选了 43 种菌，其中 7 种显示活性，即 4 种细菌：Rhodococcus spp. NCIMB 11216, NCIMB11215 和 NCIMB 11540 及 Corynebacterium sp. UPT 9；3 种真菌：Diploida gossypina ATCC 10936, Fusarium solani DSM 62416 和 Glomerella Cingulata ATCC 10534。其中第一和第四种细菌对 2-环氧辛烷有中等活性，都优先水解 R 型环氧化物形成R-1,2-二羟基辛烷，但对映选择性很低。NCIMB11540 水解 2-甲基-1,2-环氧庚烷时产生的 S-二醇和剩下的 R-环氧化物 ee 值分别为 89%和 51%，E 值为 29。NCIMB 11216[13]水解 2-甲基-1,2-环氧庚烷，2-甲基-1,2-环氧壬烷和 2-甲基-1,2-环氧十一烷时，产物 S-二醇 ee 值分别高达 96%、98%和 99%，剩下的 R-环氧化物 ee 值亦分别为 71%、25%和 55%，E值分别为 104、126 和 200，可见两个取代基差别愈大，选择性愈高，当把甲基改为乙基时，对映选择性 E 值急剧下降，其纯酶[14]表明该酶不需要辅酶，是一个溶解性的寡酶，分子量为 35 kDa，等电点为 4.7。催化 2-甲基-1,2-环氧庚烷时，最佳温度为 30°C，最佳 pH 为 8.0，这个菌可运用于芳樟醇[15](一些植物和果实的香味物质)的合成中。 另有两种菌 Rhodococcus equi IFO 3730 和 Mycobacterium paraffinicum NCIMB 10420[1]对 1,1-二取代环氧化物也显示相似的对映选择性，E 值大于 200，其中第一个菌可应用于昆虫性信息激素(S)-(-)-Frantalin[16]的合成中，在拆分过程中 E=39。 最近又发现另外 4 种菌，Nocardia sp. H8, Nocardia sp. EH1, Nocardia sp. TB1 和 Rhodococcus ruber DSM 43338[17]对 2-甲基-1,2-环氧庚烷也具有很好的选择性(E>200)。以前的情况是若得到的二醇光学活性高，但转化率总是较低，使收率很低，并且剩下的环氧化物光学活性也很低，然而，两种新菌 Nocardia sp. EH1 和 Nocardia sp. TB1 对底物的转化率都达到 50%，并且剩下的 R-环氧化物和形成的 S-二醇 ee 值都大于 99%。在长侧链上引入一个芳香基团(即底物为 4-苯基-2-甲基-1,2-环氧丁烷)则 Nocardia 菌对此底物的选择性急剧降低(EH1, E=12; TB1, E=13)。若酶水解后，再加酸处理，即两步反应在一起连续进行，则得到同一种构型的二醇[18,19]，收率都大于 90%，ee 值都大于 99%。从 Nocardia sp. EH1 中提取的粗酶[20,21]水解顺式 2,3-环氧庚烷，得到单一的产物(2R,3R)-2,3-二羟基庚烷，收率为 79%，ee 值为 91%。两种异构体的水解都发生在分子中构型为S的碳原子上，故得到(2R,3R)-二醇这一种产物。此粗酶固定化[22]于DEAE-Cellulose 后，酶的对映选择性只有很小的下降，但酶活提高了 1 倍多(为原来的 225%)，最佳温度可从 35°C 提高到 45°C，重复反应 5 次后，酶活仍有 55%。纯化后得到的纯酶[23]表明该酶不需要辅酶,是一种寡酶，分子量为 34kDa，最佳 pH 为 8~9。 以上所研究的细菌酶都显示出相似的对映选择性，比如它们都优先水解 S-2-甲基-1,2-环氧烷烃，Faber 等还分离到了另外两种具有相反对映选择性的菌株，即 Mycoplana rubra 和"Rot" [24]，第二种菌在分类学上还没有确定。对 1,1-二取代环氧化物都优先水解 R 型，但对映选择性都不高。 Faber 所研究的环氧化物水解酶都属于组成型酶，它们对 2-甲基-2-烷基环氧化物等具有分支的末端 1,2-环氧化物具有很高的对映选择性，但对于无分支的末端 1,2-环氧化物只有很低的对映选择性，并且不水解内消旋环氧化物，而南非 Botes 等[25]应用 Chryseomonas luteola 拆分 1,2-环氧辛烷，剩余的 S-环氧化物和形成的 R-二醇 ee 值分别为 98%和 86%，这是到目前为止首次报道在细菌中存在的对末端1,2-环氧化物具有很高对映选择性的环氧化物水解酶。 1995 年英国 Carter 和 Leak [26]分离到一株菌 Corynebacterium sp. C12, 所产环氧化物水解酶为诱导型酶。Archer 等[27]应用此菌拆分 1-甲基-1,2-环己烯环氧化物，有很好的对映选择性，得到(1R,2S)环氧化物，(收率 30%, ee>99%)和(1S,2S)-1-甲基-1,2-二羟基环己烷(收率 42% , 89% ee)。若随后再用酸水解剩下的环氧化物，则两步串级反应就得到单一的(1S,2S)-二醇产物(收率 80%, ee>95%)。这种诱导型酶的底物特异性范围较小，只对与诱导物相关的底物有相对较高的活性。分离得到的纯酶[28]表明该酶是一种聚合酶，其亚单位分子量为 43140Da。 1989 年荷兰 Van den Wijingard 等[29]从淡水沉淀物富集培养液中分离得到革兰氏阴性菌 Pseudomonas sp. AD1，所产环氧化物水解酶也为诱导型酶。纯化[30,31]后表明该酶是一种寡酶，分子量是 35kDa，该酶能水解表氯醇、表溴醇、环氧辛烷及苯乙烯环氧化物。基因克隆后在 E. coli 中表达[32]的重组酶水解苯乙烯环氧化物和对氯苯乙烯环氧化物[33]时对映选择性分别为 16.2 和 32.2。Rink 等[34]研究了其催化机理。除此之外，日本 Nakamura 等[35,36]发现在 Corynebacterium sp. N-1074 中存在两种环氧化物水解酶(IIa, IIb)也能降解表氯醇，其中酶 IIb 具有较高的对映选择性。 1999 年荷兰 Van Der Werf 等报道[37]发现了一类新的产生于 Rhodococcus erythropolis DCL 14 的环氧化物水解酶。单萜能诱导该菌产酶，该酶是一种寡酶，分子量为 17kDa，不需辅酶，在 pH=7 和 50°C 时酶活最高。只有柠檬烯-1,2-环氧化物，1-甲基-1,2-环己烯环氧化物，环己烯环氧化物和茚环氧化物可作为其底物。水解 1-甲基-1,2-环己烯环氧化物时对映选择性同 Corynebacterium sp. C12[27]相反，但两种情况下都得到(1S,2S)-二醇，说明该酶具有不同的催化机理。 从以上的综述可以看出，含有环氧化物水解酶的细菌比五六年前所认为的要普遍的多，这些细菌分别属于 Pseudomonas, Rhodococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Mycoplana,“Rot”, Bacillus, Agrobacterium, Xanthobacter及Chryseomonas 等，其中Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Nocardia sp. EH1 和 Nocardia sp. TB1 对 2-甲基-2-烷基环氧化物等具有分支的末端 1,2-环氧化物具有很高的对映选择性；Chryseomonas luteola 对无分支的脂肪族末端 1,2-环氧化物具有特别高的对映选择性。底物结构与酶的对映选择性的关系才刚被探讨，只有当底物具有严格的取代方式时，才具有高对映选择性。同单取代环氧化物相比，C-2 位的甲基对对映选择性有重要的作用，然而，当甲基变为乙基后就丧失了对映选择性，这表明存在着一个相当严密的活性位点，只有一部分底物能符合它。大多数酶对被测试的底物显示相同程度的对映选择性，甚至对单取代和双取代环氧化物显示相似的对映选择性的变化，这些相似性表明这些酶在进化上是具有联系的。相信随着研究的深入，会有更多的有关这方面的研究报道。组成型酶对 1,1-二取代环氧化物具有较高的对映选择性，但比活力都不高；而诱导型酶虽然比活力较高，但仅对有限的底物有活力。盼望在不久的将来可运用基因工程技术来解决这一问题。 3 真菌产生的环氧化物水解酶 虽然早期日本 Suzuki 等[38]和美国 Kolattukudy[39]等发现真菌 Helminthosporum sativum 和 Fusariun solani pis 中存在环氧化物水解酶，但真正集中研究真菌环氧化物水解酶是由法国 Furstoss 等首先进行的。他们发现 Aspergillus niger LCP 521 能不对称水解香叶醇衍生物，制备 Bower's compound[40](一种保幼激素类似物)；还可以选择性地水解非对映的 8,9-环氧柠檬烯立体异构体，制备 Bisabolol 的 4 种天然立体异构体[41]。 1993 年 Furstoss 等[5]报道了 Aspergillus niger 水解苯乙烯环氧化物剩下 S-苯乙烯环氧化物(收率 23%, 96% ee)，另一种菌 Beauveria sulfurescens 水解苯乙烯环氧化物具有良好的互补对映选择性，给出 R-苯乙烯环氧化物(收率 19%, 98% ee)，两种菌都产生同样的 R-二醇，[18O]标记实验[42]结果表明 A. niger 水解发生于 C-2，构型不变，而 B. sulfurescens 水解发生于 C-1，构型反转。若在一个反应器中，同时用这两种菌水解苯乙烯环氧化物消旋物，则得到单一的二醇产物 R-1-苯基-1,2-二羟基乙烷，收率 92%，ee 值为 89%。在水解一系列取代苯乙烯环氧化物[43](底物结构如图 4)时若苄位引入一个甲基如 2 就降低了 A. niger 的对映选择性，剩余 S-环氧化物和 R-二醇 ee 值分别为 73%和 32%；若在 b 位有取代如 3-7，则都不能作为酶的底物。 图 4 与 A. niger 和 B. sulfurescens 反应的底物 B. sulfurescens 水解 a -甲基苯乙烯环氧化物 2 时对映选择性不高；水解顺式-b -甲基苯乙烯环氧化物 3 形成的(1R,2R)-二醇在所有转化率下几乎都光学纯，而剩下的(1R,2S)-环氧化物在所有转化率下 ee 值都很低(20%)；b ,b -二甲基苯乙烯环氧化物 5 不能作为 B. sulfurescens 的底物；水解茚环氧化物 6 和 1,2-环氧四氢奈7后剩余的(1R,2S)- 环氧化物光学纯度很高(ee>98%)；水解反式-b -甲基苯乙烯环氧化物4产生的(1R,2R)-环氧化物和(1R,2S)-二醇收率(分别为 30%和 38%)和 ee 值(分别为 98%和 90%)都很好，它是唯一在转化率接近 50%时，剩余的环氧化物和二醇产物光学纯度都很高的底物，但反式-环氧化物的对映选择性水解在文献中少有报道。 对一系列对位取代苯乙烯环氧化物[44]，A. niger 都仍优先水解 R-环氧化物形成 R-二醇，剩余 S-环氧化物 ee 值都大于 96%，收率 28%~38%。水解对硝基苯乙烯环氧化物时，若随后进行酸水解[45]，则得到单一的 R-二醇(收率 94%, 80% ee)，可用于制备 b-肾上腺素阻断剂(R)-Nifenalol。酶水解时，若用粗酶[46,47]代替菌丝体，DMSO 是抑制影响最小的一种助溶剂，反应后剩下的 S-环氧化物 ee 值可达 97%，转化率为 47%，对映选择性也很高(E=41)，底物浓度可提高到 330mmol/L(54g.l-1)而不影响 ee 值，因此这个方法在制备规模的环氧化物拆分上很有用。B. sulfurescens 仍显示互补的对映选择性，当取代基是-H, -CH3, -F, -Br 时，水解剩余的 R-环氧化物 ee 值都大于 96%，除对硝基苯乙烯环氧化物外，水解所形成的二醇仍都具有 R 构型，给电子基团如 p-CH3，使反应速度增加 4 倍，而吸电子基团不仅降低反应速率还降低对映选择性，这两种现象都显示有酸催化过程存在，并且在过渡态时有碳正离子存在。 另外，A. niger 还可以对映选择性地水解对溴-α-甲基苯乙烯环氧化物[48]和缩水甘油环缩醛衍生物[49]。该酶已进行了优化生产[50]，纯化酶[51]表明该酶由 4 个相同亚基组成，每个亚基分子量为 45kDa，40°C 和 pH=7.0 时酶活最高。 除此之外，韩国 Choi[52]也筛选得到另一株 A. niger；英国 Grogan[53]也发现另一株真菌 Beauveria densa CMC 3240，都可以不对称水解苯乙烯环氧化物。 1998 年 Furstoss 等[54,55]用单取代、1,1-二取代、反式-1,2-二取代、顺式-1,2-二取代环氧化物作为底物对 42 种真菌进行筛选，得到 7 株有一定对映选择性的菌种，即 A. niger LCP 521, A. terreus CBS 116-46, B. bassina ATCC 7159, C. globosum LCP 679, Cun. elegans LCP 1543,M. isabellina ATCC 42613, Syncephalastrum racemosum MUCL 28766。 对每一类底物几乎都可以用一二个菌水解得到光学纯的对映体，结果如表 1。在用 Syncephalastrum racemosum 无细胞提取物[56]水解一系列对位取代苯乙烯环氧化物时，若对位是给电子基团如甲基有利于苄位(a 位)进攻，若对位是吸电子基团如硝基则有利于β位进攻，决定反应速率的步骤是氧环的断裂，并且是第一次揭示出在反应过程中很可能存在着环氧化物的酸活化机理。
| 表 1 几种真菌对脂肪族环氧化物的不对称水解
底物 | 菌种 | 环氧化物 收率/% ee/% | 二醇 收率/% ee/%
1,2-环氧辛烷 | M. isabellina | 18 | 97(S) | 54 | 35(R)
2-甲基-1,2-环氧庚烷 | A. niger | 22 | 99(S) | 62 | 32(R)
反式-1-甲基-1,2-环氧庚烷 | C. globosum | 12 | 97(1S,2S) | 60 | 78(1R,2S)
反式-1-甲基-1,2-环氧庚烷 | M. isabellina | 11 | 98(1R,2R) | 62 | 59(1R,2S)
顺式-1-甲基-1,2-环氧庚烷 | C. globosum | 8 | 97(1R,2S) | 59 | 58(1R,2R)
1995 年美国 Merck 研究人员[57]在 80 种真菌中筛选到 2 株能产生几乎光学纯(100% ee，但收率很低，只有 14%)(1S,2R)-茚环氧化物(是 HIV 蛋白酶抑制剂 MK639 侧链的前体，是一个有价值的手性合成子)的真菌，即 Diploida gossipina ATCC 16391 和 Lasiodiploa theobro- mae MF5215，另两种菌能产生光学纯度相当好(91% ee)的另一种对映异构体(1R,2S)-茚环氧化物，即 Gilmaniella humicola MF 5363 和 Alentaria tenius MF 4352。第一种菌可用于制备规模的拆分。 图 5 与 Rhodotorula glutinis 反应的底物 1997 年荷兰 Weijers 等[58,59]发现 Rhodotorula glutinis(一种酵母菌)可以水解一系列芳基取代、烷基取代和脂环族环氧化物，并具有较好的对映选择性，如图 5。水解芳基取代环氧化物 1, 4, 8，剩余环氧化物 ee 值大于 98%，收率可高达 48%；末端、中间、顺式和反式环氧化物水解得到的二醇 ee 值经常高达 98%；可以高对映选择性水解内消旋环氧化物 9 和 10，相应的二醇产物 ee 值分别可达 98%和 90%；(-)-柠檬烯环氧化物 11 的水解具有很高的非对映体选择性，剩余(1S, 2R,4S)-环氧化物，并产生(1R,2R,4S)-二醇产物(收率好，ee>98%)；对脂肪族末端 1,2-环氧化物，当底物的链长具有 6 个以上碳原子时，酶活较高，对 1,2-环氧庚烷和 1,2-环氧己烷都可获得较高的对映选择性，对后者，剩余 S-环氧化物和产物 R-二醇 ee 值分别为 98%和 83%，收率分别为 48%和 47%，E 值可达 84，但此菌水解 1,2-环氧辛烷时对映选择性相对较低，这促使作者以此化合物作为底物，对 187 株酵母菌进行了筛选[60]，虽然很多菌对此底物有活性，但具有一定对映选择性的菌很少，只有一些担子菌包括 Trichosporon、Rhodotorula 和 Rhodosporidium 具有较高的对映选择性，其中 Rhodotorula araucariae CBS 6031 和 Rhodosporidium toruloides CBS 0349 这两种菌既具有活性又具有较高的对映选择性(E 值分别大于 200 和 100)，水解时都是优先水解 R-环氧化物，生成 R-二醇，作者应用这两种菌进行了制备规模的拆分，把环氧化物的浓度提高 500mmol/L，无明显不良影响，反应速率只分别下降了 14%和 16%。 除以上这些真菌外，Faber 等筛选得到的 3 种真菌[12](见细菌部分)，Corynosporium cassiieda [61]和两种暗色真菌 Ulocladium atrum CMC 3280 及 Zopfiella karachiensis CMC 3284[62]中也存在环氧化物水解酶，但对映选择性较低。 真菌环氧化物水解酶一般是组成型酶，可以用普通碳源大规模培养生产。它们具有相对较广的底物范围，对芳香族、取代脂环族和无分支的脂肪族末端 1,2-环氧化物具有特别高的对映选择性。同细菌一样，含有环氧化物水解酶的真菌也比五六年前认为的多，这些真菌分别属于 Helminthosporum, Fusarium, Aspergillus, Beauveria, Cunning- hamella, Syncephalastrum, Candida, Diploida, Lasiodiploida, Gilmaniella, Alentaria, Pleurotus, Rhodotorula, Trichosporon, Rhodosporidium, Glo-merella, Corynosporium，Ulocladium, Zopfiella, Saccharomyces 等。 4 结语 目前含有环氧化物水解酶的细菌和真菌的获得仍然是通过从已知菌种中筛选(组成型酶)[1,12,17,54,55,57,60]和从土壤中分离(诱导型酶)[26,29,37,52]。在一些真核生物生物异源物质特别是芳香族化合物的生物降解过程中和一些原核生物烯烃的生物利用过程中，环氧化物及其邻二醇都作为重要的中间体，这揭示出在这些生物中都存在着环氧化物水解酶，有利于对新菌种的发现。我室已从土壤中分离到一株 Bacillus sp.，水解缩水甘油苯基醚时优先 R-环氧化物产生 R-二醇，并具有较高的对映选择性(E=33.5)，这是到目前为在止对这个底物对映选择性最高的微生物。微生物环氧化物水解酶可通过微生物发酵培养大量获得，可以设想，在不久的将来具有较高对映选择性的微生物环氧化物水解酶必可应用于工业生产上，通过拆分价格较便宜的消旋环氧化物来制备光学纯的环氧化物及邻二醇。 5 参考文献 [ 1 ] Faber K, Mischitz M, Kroutil W. 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