High Performance Thin Layer Chromatography- in Situ Immunostaining Assay Xu Guiyun (Center for Molecular Science, Institute of Chemistry, the Chinese Academy of Science, Beijing 100080) Abstract This paper describes a bioanalytical method of which higher performance thin-layer chromatography (HPTLC) is combined with immunostaing assay. This technique consists of HPTLC of micro-mixtures, in situ-immunoreaction of sample with specific ligand (antibody or virus) and determination of binding activity of ligand to sample. This method has frequently been used for studying of structure and biological function of glycolipids. Key words TLC, In situ immunoreaction, Glycolipids 摘要 本文介绍一种把高效薄层色谱与特异性酶联免疫反应相结合的原位分析方法。其实验步骤包括：混合物的高效薄层色谱分离，与特异性给体(抗体或病毒)的原位免疫结合以及结合能力的测定。这种方法主要被用在微量糖脂组分的结构鉴定以及糖脂生物功能的研究等领域。 关键词 薄层色谱 原位免疫反应 糖脂 高效薄层色谱-原位免疫分析 徐桂云 (中国科学院化学研究所 ，分子科学中心 北京 100080) 随着生命科学研究的深入发展， 生物组织或体液中一些微量的物质越来越引起科学家们的浓厚兴趣。对于这些物质的分离分析常采用柱色谱、薄层色谱、液相色谱和质谱技术。但是对于那些具有重要生物功能而含量甚低(低于十万分之一)的物质，即使经过反复富集的浓缩，仍然得不到供研究所需要的纯品量。高效薄层色谱(HPTLC)除了与其它色谱技术一样具有分离能力之外，它独有的优点是能够在 HPTLC 板上进行原位反应和原位检测。即从生物组织中提取的混合物经 HPTLC 分离后，利用免疫反应具有的高度特异性，在 HPTLC 板上直接与给体(抗体或毒素)进行原位免疫反应，再与酶标记或同位素标记的第二抗体进行原位反应，最后与酶的底物反应使之生成有色物质以其定性。使用 TLC 扫描仪测定光密度进行定量。这是一种综合利用 HPTLC 的高分离效率，免疫反应的高度特异性，以及酶联显色的高灵敏性的原位分析方法。把传统的 HPTLC 和酶联免疫反应测定技术发展到一个崭新的水平。省去了纯化纯品的复杂步骤。为微量生化物质的研究提供了一种有用的检测方法。 1 实验方法[1,2] 1.1 HPTLC 分离 用于 HPTLC-原位免疫分析的硅胶板除了具有好的分离性能之外，硅胶涂的必须牢固，以防止在实验中经多次洗涤硅胶脱落。Nagel(德国)公司的以塑料片或铝片为支持体的硅胶板具备这些性能。硅胶板的尺寸一般用 10×0cm, 硅胶涂层厚度为 0.5mm。对于展开剂的要求除了对要鉴定的物质有分离能力之外，要呈中性(pH6.8-7.2), 并且挥发性要好，在温和的条件下易于除去。目的是使 HPTLC 板上的物质保持免疫活性。 1.2 HPTLC 板的处理 在每一步原位免疫反应之前，都要对 HPTLC 板进行处理。目的是避免非特异性反应。将完成样品分离的 HPTLC 板经干燥后，放入一个塑料盒子中，用滴管缓慢加入 0.1ml/cm2 的含 1%鸡清蛋白和 1%的聚乙烯吡咯啉酮的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)。在室温下浸泡 2h 后移出浸泡液，用滴管沿塑料盒子壁缓慢加入磷酸盐缓冲溶液，轻轻摇动盒子 2min 后，用滴管吸出洗涤液。重复洗 HPTLC 板 3-5 次。 1.3 原位免疫反应 将处理好的 HPTLC 板放入盛有反应介质和反应物的塑料盒子中，反应条件要根据实验内容而确定。例如检测糖脂抗原时，盒子中加入 0.1ml/cm2 含特异性糖脂抗体的缓冲溶液，HPTLC 板上的糖脂与抗体在 4°C 下反应 2 h。又如检测病毒与受体结合能力时，盒子中加入含有病毒的缓冲溶液，HPTLC 板上的受体物质与病毒在 4°C 下至少反应 9 h。移出反应液，HPTLC 板经洗涤后，再与抗病毒抗体反应 2 h。 1.4 免疫反应的鉴定 酶联抗体市场上有售。酶是作为免疫反应的示踪物，最常用的是辣根过氧化酶。最后将已形成抗原抗体复合物的 HPTLC 板，置于含有酶联抗体的塑料盒子中，在 4°C 下反应 2h。移出反应液，洗涤 HPTLC 板后，在室温下加入酶的底物，反应生成有色产物。用蒸馏水小心洗涤 HPTLC 板之后，用热风充分干燥，使用 TCL 扫描仪测定有色产物的光密度值定量。若采用放射免疫分析时，加入同位素标记的第二抗体与特异性抗体在室温下反应 2 h。取出 HPTLC 板充分干燥，将 X 光片放在 HPTLC 板的正面，夹紧置暗室过夜，冲洗Ｘ光片，显示自显影谱带。 2　应用 2.1 微量糖脂抗原的检测 HPTLC-原位免疫分析技术既具有分离能力，又具有检测特异性，也具有高的检测灵敏度。从而能在 HPTLC 板上检测出在一般薄层层析显色技术不能检测的微量组分。这对于那些具有重要生物功能，而在组织中含量甚低或材料来原十分困难的糖脂研究工作是十分方便的。所以它已经成为寻找新的糖脂抗原和检测体液或组织中与疾病相关的微量糖脂成分的重要手段。例如 Ogiso 等[3]在研究白内障的发生与眼球晶体中糖脂的关系工作中，平林义雄等[4]发现鸡肠内组织中含有 Lex 结构 GM1 的工作中均应用 HPTLC-原位免疫技术检测糖脂。又如肠癌， 腺癌组织以及嗜铬细胞瘤中含岩藻糖神经节苷脂抗原的发现[5,6]；使用 Gg4 抗体在 HPTLC 板上鉴定牛脑子中神经节苷脂糖链结构[7]；以及 Lewis 血型糖脂抗原[8]的检测都应用到 HPTLC-原位免疫分析技术。 2.2 流感病毒受体特异性测定 HPTLC-原位免疫分析技术为流感病毒受体研究提供了有用的方法。流感病毒是最易发生变异的病毒，产生许多种亚型株。它们的受体特异性也不同。流感病毒的受体是一类含唾液酸的寡糖缀合物。这类物质结构复杂，并且在人和动物细胞含量甚低。使传统的酶联吸附和分子结合细胞模拟方法受到了限制。 因为这两种方法的实验中必须使用纯品。特别是后者消耗样品量大。HPTLC-原位免疫分析能够从复杂混合的糖脂样品中筛查出受体的组分。如人 C 型流感病毒在 HPTLC 板上特异性地识别出寡糖末端含 9-O-乙酰基唾液酸的糖脂[9]；Suzuki 等[10]使用 12 种神经节苷脂研究A型流感病毒的受体特异性时，方便地在 HPTLC 板上鉴定出 A/PR/8/34 亚株特异性结合六种糖脂(图 1)。作者[2,11]应用这种技术，定量地测定了 B 型流感病毒对于不同唾液酸键型(2-3,2-6)的糖脂结合能力的差异。 图 1 流感病毒与在 HPTLC 板上的神经节苷脂结合的谱图[10] HPTLC 板：Polygram sil G(Nagel, Germany). 展开剂：氯仿:甲醇:水 12mM MgCl2(5:4:1v/v)。载有神经节苷脂的 HPTLC 板与流感病毒 A/PR/8/34(28HAU), 在磷酸盐缓冲溶液中，置 4°C 下反应 9h 后，与抗病毒抗体反应 2h，再与辣根过氧化酶标I gG 反应 2h, 最后在 Tris-HCl 缓冲溶液中(PH 7.2)与 4-氯萘酚显色。a, GM3; b, IV3(Neu5Ac)Lc4Cer; c, IV6(Neu5Ac)Lc4Cer; d, GM1b; e, GD1a; f, GT1b; g, GM3(Neu5Gc); h, GM2; i, IV3(Neu5Ac)nLc4Cer; j, IV6(Neu5Ac)nLc4Cer; k, GM1a; l, GD1b. 1,50pmol; 2,100pmol; 3,150pmol; 4,200pmol. 3 参考文献 [1] Magnani J L, Brockhaus M, Smith D F et al. A monosialoganglioside is a monoclonal antibody-defined antigen of colon carcinoma, Science, 1981, 212: 55-56 [2] Xu G Y, Suzuki T, Tahara H et al. Specificity of sialyl-sugar chain mediated recognition by the hemagglutinin of human influenza B virus isolates, J Biochem, 1994, 115: 202-207 [3] Ogiso M, Okinaga T, Ohta M et al. Identification and synthetic pathway of sialyl-Lewisx-containing neolacto-series ganglioside in lens tissue. 1. Characterization of gangliosides in human senile cataractous lens, Biochim Biophys Acta, 1995, 1256:166-174 [4] Hirabayashi Y, Fujia S C, Kon K et al. Characterization of a novel Lex-active ganglioside from chick intestinal tissues recognized by murine monoclonal antibody 188CI, J Biol Chem, 1991, 266:10268-10274 [5] Watatai S, Kiura K, Shigeto R et al. Establishment of monoclonal antibodies specific for ganglioside GM1, detection of ganglioside GM1 in small cell lung carcinoma cell lines and tissues, J Biochem, 1994, 116: 948-954 [6] Fukushi Y, Nudelman E, Levery S B et al. Novel fucolipids accumulating in human adenocarcinoma, J Biol Chem, 1984, 259:10511-10517 [7] Margolis R U, Mazzulla M, Greene L A et al. Fucosyl gangliosides of PC12 pheo-chromocytoma cell, FEBS Lett, 1984, 172: 339-342 [8] Hansosn G C, Karlsson K A, Larson G et al. Mouse monoclonal antibodies against human cancer cell lines with specificities for blood group and released antigens, J Biol Chem, 1983,258: 4091-4097 [9] Zimmer G, Reuter G, Schauer R. Use of influenza C virus for detection of 9-O-acetylated Sialic acid on immobilized glycoconjugates by esteraseactivity, Eur J Biochem, 1992, 204: 209-215 [10] Suzuki Y, Nagao Y, Ito T et al. Structural determination of gangliosides that to influenza A, B and C virus by an improved binding assay, Virology, 1992, 189: 121-131 [11] Xu G Y, Horiike G, Suzuki T et al. A novel strain, B/Gifu/2/73, differs from other influenza B virus in the receptor binding specificity toward sialo-sugar chain linkage, Biochem Biophys Res Commun, 1996, 224: 815-818 徐桂云 48 岁，副研究员，从事糖的结构分析以及结构与生物学功能的研究。