Progress on Structure-Activity Relationship by NMR Methods Wang Ming'an (Department of Applied Chemistry, China Agricultural University, Beijing 100094) Abstract In this paper, two kinds of NMR methods which were used in structure-activity relationship research were introduced. They were structure-activity relationship by 13C NMR and 2D 15N/1H HSQC spectrum. Key words Structure-Activity Relationship, 13CNMR, SAR by NMR 摘要 介绍了核磁共振技术在构效关系研究中的应用，包括：1) 13C NMR 在构效关系研究中的应用；2) SAR by NMR 新方法的应用，重点介绍第二种方法。 关键词 构效关系 13C 核磁共振 SAR by NMR 核磁共振技术在构效关系研究中的应用 王明安 (中国农业大学应用化学系 北京 100094) 核磁共振技术在各个领域中已获得广泛应用。在创制新医药，新农药的过程中，1H、13C、31PNMR 等对于表征化学结构起着至关重要的作用。与此同时，化学结构与生物活性间的构效关系研究对于新药的分子设计无疑起了巨大的推动作用。原有的 QSAR 研究中主要使用电子效应参数、立体效应参数和疏水性参数。除疏水性参数外，电子效应和立体效应是影响核磁共振化学位移的主要因素。因此，如何使用这两种效应，把核磁共振化学位移与构效关系研究联系起来，成为化学家、药学家及生物学家共同追求的目标，将会开创新药分子设计的新局面。为此，本文介绍两种探索方法，并重点讨论后一种方法。 1 13C NMR 在结构-活性关系研究中的应用 早在 1986 年, Sakamoto 等[1]在研究多环、氯代单环芳烃的致癌活性和化学结构的关系时，根据芳香族化合物的电离能在一定范围内显示有致癌活性，并随电离能的减小而致癌活性增加的规律，以及芳香族化合物的 13C NMR 化学位移与电离能及每个碳原子的电子环境密切相关的原理，提出可以用 13C NMR 化学位移来度量一个化合物是否具有致癌活性。一个 i 核的 13C NMR 化学位移在具有相近的平均激发能时，顺磁性贡献是主要影响因子： (1) Δ E 是一个分子的平均激发能，Q 是包含电子密度和键级的因子。因此定义平均化学位移： (2) 这里，N是所有芳环碳原子的数目。从这一方程可以看到，平均化学位移包含了平均激发能和 Q 的平均值，所以可以间接地通过观测分子中所有环碳原子的平均化学位移(d av)来获得芳香族化合物的电子结构和状态的信息，从而与化合物的致癌活性相关连。 Sakamoto 等[1-5]先后研究了 90 余个多环芳烃，44 个氯代单环芳烃及 28 个含氮杂环化合物的 13C NMR 平均化学位移和致癌活性的关系，得出把平均化学位移 dav作为一个指数,用于衡量一个化合物是否具有致癌活性，这个指数称为“致癌指数”(Carcinogenic index)。对于多环芳烃、氯代单环芳烃、含氮杂环化合物致癌指数分别为 d av126.80～127.87，127.76～132.64，129.43～132.12，由于氯、氮原子的吸电子特性，与多环芳烃相比较，氯代单环芳烃及氮杂环化合物的平均化学位移向低场移动，结果导致两类化合物“致癌指数”的差别，这种差别可能正反映出这几类化合物在致癌机制上的细微差异。图 1 是 26 个多环芳烃的 13C NMR 平均化学位移和致癌活性的关系图[5]。 图1 13C NMR平均化学位移(d av)与致癌活性的关系 Sakamoto等[3]证明，当用13C NMR dav作参数时，致癌活性化合物相关的新陈代谢转化过程的几项量子化学指数(如离域能, B-区p电子键级、电子密度、超离域性等)与多环芳烃的致癌活性相关，这一发现表明dav还可用于新陈代谢的转化过程。通过对3个致癌活性差异极大的化合物各个碳原子的13C NMR化学位移和致癌活性的关系进行研究发现，7,12-二甲基苯并蒽，7-甲基苯并蒽以及1-甲基苯并蒽在C1, C2, C6位的化学位移值有特征性的差异,即致癌的前两个化合物与非致癌的后一个化合物相比，C1, C2, C6化学位移大2以上。分子轨道计算结果表明：致癌活性化合物的C1, C6原子的电子密度比非致癌活性化合物相应原子的电子密度高[5]。 Sakamoto等还开发了用于结构-活性相关关系研究的神经网络模拟器(NECO)，把13C NMR化学位移作为结构数据，致癌活性作为预报结果发现多环芳烃在L、K和Bay三个区域的电子密度与致癌活性有强烈的相关性[6,7]，同时首次将神经网络模拟器的方法用于研究非芳烃，发现用降冰片烯的各个环碳的13C NMR平均化学位移可以正确预言降冰片烯及其衍生物的exo/endo取向，并证明7个碳原子中仅有两个碳的化学位移与exo/endo取向有强烈的相关性[7,8]。 对环腺苷酸(cAMP)磷酸二酯酶(PDE)的抑制可用作检测各种生理活性化合物的筛选试剂[9]，已知经体外筛选过的158种具有PDE抑制性能化合物与体内的PDE抑制活性密切相关，许多黄酮类化合物已证明具有cAMP PDE抑制活性。这些结果表明PDE抑制剂可能具有广泛的生理活性，但是用传统方法来测定这些生理活性要花很长时间。Sakamoto等[10]研究了48个黄酮，35个黄烷酮，6个异黄酮的化学结构与cAMP PDE抑制活性间的关系，发现所有具有cAMP PDE抑制活性的化合物(IC50 0.6-20.0×10-5M/L)，所有环碳的平均13C NMR化学位移(dav)介于133.5-135.7ppm之间，而无活性及弱活性的黄酮则不在此范围内。因此dav可作为测试cAMP PDE抑制活性的一项指数，并以此作为替代传统测试PDE抑制活性的一种方法，这种方法在药物设计中将是非常有益的。 2 通过NMR谱研究结构-活性关系(SAR by NMR) 发现新药的传统方法是通过从化合物库或天然产物中筛选具有活性的先导化合物，再合成结构相关的类似物进行优化，这是一种费时、费力的方法，也需要偶然的机遇。药物合理设计(rational design)的方法在开发新药过程中扮演了非常重要的角色，在优化过程中也依赖于个人的经验和利用分子结构的知识，但由于过分强调合理设计，仅仅通过分子设计要得到人们预期具有优良性能的药物并不总能成功，因此人们开始醒悟，药物合理设计的方法并不总是有效。组合化学(combi-chem)的方法给新药的研究提供了新的推动力，不久人们也开始觉醒，在这种新方法发展过程中，已经受到明显的限制[11,12]。最近，美国Abbott实验室的Fesik研究组发表了一项开创性的研究工作，巧妙地将合理设计与组合化学的优点结合起来，并将这种方法称为“SAR by NMR”，即通过NMR谱研究结构-活性关系[13,14]，从而为新药研究提供了新的思路和启示。 “SAR by NMR”这种新方法包含了5个步骤：(1) 从低分子量化合物库中筛选并识别结合于靶标蛋白(酶)第一配体；(2) 优化结合于这一部位的第一配体；(3) 筛选并确定结合于第一配体部位的邻近部位的第二配体；(4) 通过筛选结构相关类似物优化结合于这一部位的第二配体；(5) 通过多维NMR方法或X射线衍射方法确定三元配合物中两配体的位置及取向，然后再根据这一结构信息将两配体通过一个连结子(linker)连接起来，以合成高亲和力的配体-目标药物分子，因为这种方法主要依赖于NMR来完成,所以称之为“SAR by NMR”。图2是“SAR by NMR”方法的原理图。 究竟如何识别结合于目标蛋白(酶)上的第一、二配体是这项技术的核心。Fesik研究组在一篇专利中详细介绍了识别的方法，即通过识别加入配体前后在二维异核单量子相关谱(2D 15N/1H HSQC)中酰胺1H或15N化学位移的变化来确认[15]。根据Fesik等的经验， 15N标记蛋白在500MHz NMR谱仪上，可以在10～15min内获得一张分辩好的2D HSQC谱，使用自动换样器，则每天可以测试100个样的2D HSQC谱，如以10个化合物的混合物为一组进行测试，每天可筛选1000个化合物。在另一篇专利中，详细介绍了根据上述方法得到第一、二配体后，如何设计结合于目标蛋白分子上的新化合物的方法，即通过确定三元配合物中配体的确切部位及空间取向，用连结子连接两个配体形成新的化合物，并保持以前相同的空间取向以保证进入相同的结合部位[16]。
| 图 2 SAR by NMR 原理 |  | 图 3 应用 SAR by NMR 方法于 FKBP 的总结
目前应用这种新方法取得了巨大的成功。免疫抑制剂FK506(1)结合蛋白FKBP与FK506结合后可抑制钙调磷酸酶(Calcineurin，一种丝氨酸-苏氨酸磷酸酶)并阻碍T细胞活化，FKBP对器官移植中免疫反应的抑制是很重要的。Fesik等人[13,14,17]用2D HSQC谱方法，筛选出化合物2对FKBP显示了最高的亲和力(用Kd表示, Kd=2.0uM, Kd可通过2D HSQC谱中酰胺化学位移的变化作为化合物浓度的函数来获得)[18,19]，这个化合物未作任何优化作为第一配体；在饱和量的化合物2存在下，从化合物库筛选到一个与FKBP亲和力Kd为0.8mM的化合物3，并根据HSQC谱中化学位移的变化说明化合物3的结合部位与化合物2的结合部位相邻。在此基础上，对化合物3进行优化，筛选到一个与FKBP亲和力Kd为100uM的最优配体9。通过对化合物2、9与FKBP三元配合物的同位素滤波NMR(isotope-filtered NMR)研究所得的模型，认识到化合物2的甲酯基与化合物9的苯甲酰基环上的羟基很近，于是通过连结子设计合成了5个化合物10～14，结果得到的5个化合物对FKPB的亲和力Kd均达到nM级,其中化合物10的Kd为19nM，这是FKBP的一个高亲和力配体。图3是对这一研究过程的总结。 子宫金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases)是一组隶属于锌的内蛋白酶，包括胶原酶，明胶酶和基质溶酶(collagenaes, gelatinases and stromelysin)，子宫退化和组织再生过程都与这种酶有关，当过分表达或调节不当都会伴随病理症状如关节炎或肿瘤转移。Fesik 研究组[18]最近报道了通过“SAR by NMR”方法，发现了基质溶酶的非肽类抑制剂。用 HSQC 谱方法从化合物库中筛选到乙酰羟胺(CH3CONHOH,15)对基质溶酶的亲和力很弱，Kd=17mM，由于它的分子较小以及在缓冲液中的溶解度较大(大于500mM)，未作任何优化选作第一配体。在饱和量的乙酰羟胺存在下，用 HSQC 谱方法发现联苯及其类似物可以结合基质溶酶 Kd 在 mM 范围，经过近 40 余个联苯化合物的结构-活性研究比较，发现 3'-氰甲基-4-羟基联苯(16)与基质溶酶的亲合力 Kd 达 0.02mM。通过对乙酰羟胺，3'-氰甲基-4-羟基联苯类似物以及基质溶酶的三元配合物的NMR研究，设计合成了 11 个化合物(17～27)，生物活性实验证明，与原有单体化合物相比，所有化合物的活性均有增强。对基质溶酶最具抑制活性的化合物 22 和 25 其 IC50 分别为 25 和 15nM，活性增强近千倍。当用传统酶抑制方法筛选了大约 115000 个化合物,没能发现一个非肽类抑制剂其活性 IC50 小于 10 m M；相反他们仅用了大约 6 个月的时间就获得了高活性的化合物，可见这种方法是相当成功的。
表 1 联苯类基质溶酶抑制化合物
Compound No. | R1 | R2 | n | IC50/m M
17 | H | H | 1 | 3.9
18 | H | H | 2 | 0.31
19 | H | H | 3 | 110
20 | H | H | 4 | 100
21 | H | CN | 1 | 0.26
22 | H | CN | 2 | 0.025
23 | H | CN | 3 | 3.4
24 | H | CN | 4 | 3.5
25 | CH2CN | H | 2 | 0.015
26 | CH2CN | H | 3 | 1.9
27 | CH2CN | H | 4 | 3.5
乳头瘤病毒是一小组 DNA 肿瘤病毒，它会感染各种各样的哺乳动物细胞，是引起皮肤或肌肉良性增生损伤的因素，以及在子宫颈癌和其它恶性肿瘤发展过程中与血缘有关的原因。所有乳头瘤病毒都包含一种 DNA 结合蛋白 E2，它能调节几种病毒基因的复制，与 E1 蛋白一起成为病毒复制所必需的条件。许多研究表明，E2 蛋白是开发治疗人类乳头瘤病毒(HPVs)的一种目标蛋白。与同族 DNA 结合的牛 E2 蛋白的 DNA 结合区(DBD)的 X 射线衍射结构已经获得，Fesik 研究组也已获得了 HPV-31 E2 DBD 的溶液结构。据此 Fesik 研究组[19]再次利用“SAR by NMR”方法发现了阻碍 HPV E2 蛋白与 DNA 结合的先导抑制剂。作者用 HSQC 谱发现三种可与 E2 蛋白结合的配体，如表 2 所示，进一步研究发现化合物 28 和 29 可以抑制 E2 与 DNA 的结合，而化合物 30 则不能抑制，因此选择化合物 28、29 作为初始配体。经过多种 NMR 方法研究了 E2/28 配合物的三维结构(如图 4 所示)后发现，化合物 28 结合在 DNA 识别螺旋及邻近环孔之间的疏水腔内，联苯结构片段使化合物 28 与 E2 蛋白的 Leu306, Leu3.9, Leu313, Val358, Ile360 和 Pro361 残基形成疏水性接触,这表明这类化合物所显示的抑制 DNA 与 E2 蛋白的结合活性是由于 E2 蛋白上 DNA 结合部位的堵塞所致。
表 2 用 SAR by NMR 方法发现的 E2 蛋白初始配体
NO. | 化合物 | Kd/mM | 结合部位 | 对 DNA 结合的抑制
28 |  | 2.5 | DNA 识别螺旋 | +
29 |  | 1.9 | DNA 识别螺旋 | +
30 |  | 0.6 | b-折叠 | —
| 图 4 E2 蛋白的 DNA 结合区与 28 配合物的三维结构 |  | 图 5 用 SAR by NMR 方法发现的 HPV-E2 DBD 抑制剂
在此基础上，作者合成了 27 个联苯羧酸衍生物，通过 NMR 方法测定了它们的亲和力发现 3', 5'-二氯-联苯羧酸(31)的 Kd 为 0.06mM, IC50 为 0.15mM，是活性最好的化合物，与联苯羧酸相比 Kd 增加了近 40 倍。同时对二苯醚类化合物进行优化，发现化合物 32 具有对 E2 蛋白弱的亲合力及良好的活性 Kd 为 0.35mM，IC50 为 75 m M，因此选定它们为第一、二配体。进一步研究发现，当 31 和 32 加入到 E2 蛋白中,两类配体引起同一位置酰胺位移的变化,这表明两类化合物结合于 E2 DBD 的同一位置，因此推断根据两类化合物所得到的 SAR 可以组合进一个简单分子中。为此设计合成了目标分子 33，结果经生物测试发现，它是这个系列中最具潜力的化合物，IC50 为 10 m M，这一过程简单地用图5进行总结。 上述三个实例是非常成功的，给人的启示是深刻的。“SAR by NMR”方法的优点在于： (1)使用 2D 15N/1H HSQC 谱来检测结合于 15N 标记蛋白(酶)的小分子配体，由于 15N 谱的编辑功能观测不到来自配体的信号，因此即使在高浓度时也能检测到这种结合；(2)使用 HSQC 谱可以迅速检测到不同配体的不同结合部位，这对于阐明结构-活性关系以及指导配体连接化合物的合成是至关重要的。如果不能获得足够量的 15N 标记蛋白，则 HSQC 谱方法不再适用。新近作者又开发了两种不需要 15N 标记蛋白的新方法——一维驰豫编辑和扩散编辑NMR方法[20]，弥补了这种方法的不足。(3)“SAR by NMR”方法的优点还在于如从 1000 个化合物的库中筛选两个结合部位的先导配体相当于传统方法筛选 1000×1000=1,000,000 个化合物，这种方法相当快(如上述实例二的成功仅用 6 个月时间)，而传统方法要长得多。(4)两个配体可通过不同的连结子(linker)连接起来，这种连接还从焓变和熵变对结合能的贡献上得到了理论支持[21]。 “SAR by NMR”方法在概念上类似于组合化学，然而这两种方法有本质的区别，在组合化学中发现配体需要制备测试大量的化合物，不幸的是，合成方案的选择和生物测定往往既困难又费时，进而相对统一的条件需要限制了有用的分子构建模块及化合物的多样性。在“SAR by NMR”方法中，配体已预选进行了优化，所以只需合成少数几个化合物即可。另一方面“SAR by NMR”方法不同于组合化学，筛选小分子化合物的范围仅仅受到水溶解度达 mM 浓度的限制，结果可以收集到多种多样的化合物样品。“SAR by NMR”这种方法也受到一定的限制：(1)需要高场 NMR 谱仪(500MHz 以上)；(2)大量的 15N 标记蛋白(200mg 以上)；(3)靶标蛋白(酶)的分子量小于 40KD；(4)靶标蛋白(酶)在水中的溶解度达 0.2mmol.L-1 浓度；(5)用于检测的小分子在水中的溶解度达 mmol.L-1 浓度。 总之，本文从两个方面介绍了核磁共振技术在构效关系研究中的应用。第一种 13C NMR 方法类同于传统的 QSAR 研究，对于新药分子设计是有益的，第二种方法是全新意义上的创新方法，相信随着人们对农药，医药的作用机制及靶标蛋白(酶)的三维结构的深入了解和相关功能的研究，利用这种方法会加速新农药、新医药的创制过程，这无疑对于即将进入 21 世纪的我国新药创制体系的形成和发展产生深远的影响。 3 参考文献 [1] Sakamoto Y, Watanable S. Bull. Chem. Soc. Jpn., 1986, 59(10):3033. [2] Sakamoto Y, Sakamoto Y. Bull. Chem. Soc. Jpn., 1989, 62(1):33. [3] Sakamoto Y, Ohshima S, Ohmoto T. Chem. Pharm. Bull., 1992, 40(8):1981. [4] Sakamoto Y, Aoki T, Ohshima S. Chem. Pharm. Bull., 1996, 44(2): 424. [5] Sakamoto Y, Aoki T, Ohshima S. Polycyclic Aromatic Compounds, 1996, 11(1-4):245. [6] Isu Y, Nagashima U, Hosoya H et al. J. Chem. Software, 1996, 3(1):1. [7] Isu Y, Nagashima U, Aoyama T et al. J. Chem. Inf. Comput. Sci., 1996, 36(2):286. [8] Isu Y, Nagashima U, Hosoya H et al. J. Chem. Software, 1994, 2(2):76. [9] Nikaido T, Sung Y I, Ohmoto T et al. Chem. Pharm. Bull., 1984, 32(3):578. [10] Sakamoto Y,Ohmoto T, Nikaido T, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1989, 62(8):2450. [11] Balkenhohl F C, Von dem Bussche-Hunnefedt, A. Lansky et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1996, 35:2289. [12] Kessler H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36(8):829. [13] Shuker S B, Hajduk P J, Meadons R P et al. Seience, 1996, 274 (29):1531. [14] Fesik S W, Shuker S B, Hajduk P J. Protein Eng., 10 (Suppl.), London: Oxford University Press, 1997:73. [15] Fesik S W, Hajduk P J, US Appl. 555691, 1995; CA:127, 47445e. [16] Fesik S W, Hajduk P J, Olejniczak E T, US Appl. 678903, 1996; CA:127, 60605b. [17] Hajduk P J, Meadons R. P, Fesik S W. Science, 1997, 278 (17):497. [18] Hajduk P J, Sheppard G, Nettesheim D G, et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119(25):5818. [19] Hajduk P J, Dinges J, Miknis G F, et al. J. Med, Chem., 1997, 40(20):3144. [20] Hajduk P J, Olejniczak E T, Fesik S W. J. Am. Chem. Soc., 1997, 119(50):12257. [21] Olejniczak E T, Hajduk P J, Marcotte P A, et al. J. Am. Chem. Soc., 1997, 119 (25):5828.