Tu Chuqiao, Liang Hong, Wang Guanghui#
(Department of Chemistry, Guangxi Normal University, Guilin 541004 China
#College of Chemistry, Wuhan University, Wuhan 430072 China)
Abstract
Kinetic experiments were performed to study the effects of Pt(Ⅳ) on the oxidation of
5,6-dibromo-2,3-dicyanohydroquinone(DDBQH2) catalyzed by Rhus vernicifera
laccase under condition of pH 4.4 and 30±0.2℃. The results showed that the mixed
inhibition could be observed when Pt(Ⅳ) was at low concentrations, the competitive and
non-competitive inhibition constants were 3.0×10-6 and 7.5×10-6
mol/L, respectively. With the increase of Pt(Ⅳ) concentration, the inhibition was
gradually converted into activation which we suggest to be mixed type, and the competitive
and non-competitive activation constants were 285.7×10-6 and 62.5×10-6
mol/L, respectively. With the extension of mixed time of Pt(Ⅳ) with laccase, the
activation on the laccase activity was obvious strengthened, but the inhibition only went
up a little. The absorption spectrum of laccase mixed with Pt(Ⅳ) suggests that it is the
type 1 site and type 3 site in laccase with which Pt(Ⅳ) interacts.
Keywords Rhus vernicifera
laccase , Pt（Ⅳ）, inhibition and activation
摘要
通过动力学方法研究了pH 4.4和30±0.2℃条件下Pt(Ⅳ)对漆树漆酶催化氧化5，6-二溴-2，3-二氰基氢醌（DDBQH2）的影响。结果表明，当Pt(Ⅳ)浓度较低时，它对酶催反应有混合性抑制作用，竞争性和非竞争性抑制剂常数分别为3.0×10-6
和7.5×10-6 mol/L；随着Pt(Ⅳ)浓度的增加，抑制作用逐渐转变为活化作用，这种活化作用暂时被称为混合性活化作用，竞争性和非竞争性活化剂常数分别为285.7×10-6
和62.5×10-6 mol/L。随着Pt(Ⅳ)与漆酶混合时间的延长，Pt(Ⅳ)对漆酶活性的活化作用明显加强，但抑制作用变化不大。与Pt(Ⅳ)混合一定时间后的漆酶的吸收光谱表明，漆酶分子中的Ⅰ型铜位和Ⅲ型铜位可能是Pt(Ⅳ)的作用位点。
关键词 漆树漆酶 Pt（Ⅳ） 抑制和活化
Pt（Ⅳ）对漆树漆酶催化活性的影响
涂楚桥 梁宏** 王光辉#
（广西师范大学化学化工系 桂林 541004 #武汉大学化学学院
武汉 430072）
铂不仅是重要的催化剂，也是重要的抗癌元素。目前对铂的各种化合物的研究几乎都集中在抗癌性上，而以Pt（Ⅳ）为效应物考察对酶催化活性影响的报道极少[1,2]。本文以5，6-二溴-2，3二氰基氢醌（DDBQH2）为底物，用分光光度法考察了Pt（Ⅳ）存在下的漆酶催化氧化反应和漆酶的吸收光谱变化，探讨了它对漆酶催化活性的影响。
1 实验部分
1.1 试剂和仪器
漆酶的分离纯化和底物（5，6-二溴-2，3二氰基氢醌，简称DDBQH2）的合成按文献[3]进行。K2PtCl6，NaNO3，HAc和NaAc均为分析纯试剂。底物溶液用无水乙醇配制，HAc-NaAc缓冲溶液（pH4.4）用去离子水配制，内含0.1
mol∕L NaNO3以维持相同的离子强度。其余溶液均用缓冲液配制。Pt（Ⅳ）溶液避光保存，其浓度用WFX-IF2型原子吸收分光光度计测定。实验均在0.1
mol∕L HAc-NaAc缓冲液（pH4.4）中和(30±0.2)℃条件下进行。
实验所用仪器为岛津UV-240型紫外-可见分光光度计。
1.2 Pt（Ⅳ）对漆酶催化活性的影响
取一定体积的缓冲液于1cm比色皿中，加入一定量的底物和Pt（Ⅳ）溶液，预热达热平衡后，加入一定量的漆酶液（此时比色皿中的溶液总体积为3.00±0.02ml）启动反应。定时追踪反应开始后3分钟内底物特征吸收处（389nm）吸光度值随时间的变化，求出反应初速度v0。
1.3 Pt（Ⅳ）与漆酶混合时间对漆酶催化活性的影响
取一定体积的缓冲液于1cm比色皿中，加入一定量的漆酶液和Pt（Ⅳ）溶液，放置不同时间后，加入一定量的底物溶液（此时比色皿中的溶液总体积为3.00±0.02ml）启动反应。定时追踪反应开始后3分钟内底物特征吸收处（389nm）吸光度值随时间的变化，求出反应初速度v0。
1.4 Pt（Ⅳ）对漆酶吸收光谱的影响
取漆酶液2.0ml，绘制800-290nm范围的吸收光谱图。加入一定量的Pt（Ⅳ）溶液后，再定时绘制漆酶的吸收光谱图。
2 结果与讨论
2.1 对漆酶催化活性的作用
由于Pt（Ⅳ）有较强的氧化性，首先在实验条件下观察了它对DDBQH2的氧化情况。发现在DDBQH2的浓度为1.1×10-3mol∕L，Pt（Ⅳ）浓度大于4.26×10-4
mol∕L时，开始对DDBQH2表现出可以观察到的氧化作用。因此在实验中严格控制[DDBQH2]:[Pt（Ⅳ）]
> 2.6:1。
Pt（Ⅳ）对漆酶催化活性的影响表现为抑制和激活两种作用，并与Pt（Ⅳ）的浓度及漆酶和Pt（Ⅳ）的作用时间密切相关。就浓度而言，如图1所示，随着Pt（Ⅳ）浓度的增加，漆酶的催化活性先是被抑制，然后又被激活，最大抑制率和最大激活率[3]分别可达-28%和+50%。就时效性而言，如图2，在抑制区（见图1）内选择一个Pt（Ⅳ）浓度，发现随着Pt（Ⅳ）和漆酶作用时间的延长，抑制率变化不大；在激活区内选择一个Pt（Ⅳ）浓度，发现随着作用时间的延长，激活率明显上升。
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| 图1 [Pt（Ⅳ）]对漆酶催化活性的影响 | 图2 Pt（Ⅳ）与漆酶混合时间对漆酶催化活性的影响 |
| [DDBQH2]：1.1×10-3mol∕L。DDBQH2和Pt（Ⅳ）预孵化12分钟后，加入漆酶启动反应。 | [DDBQH2]：1.1×10-3mol∕L。 [Pt（Ⅳ）]：▲1.07，●28.7×10-6 mol∕L。Pt（Ⅳ）和漆酶预孵化一定时间后，加入DDBQH2启动反应。 |
2.2 作用特征
在抑制区（见图1）内选择不同的Pt（Ⅳ）浓度测定酶促反应的L-B图，发现Pt（Ⅳ）的抑制作用具有不常见的混合性（竞争性和非竞争性）特征[4]。以L-B图斜率和纵坐标截距分别对[Pt（Ⅳ）]作图[4]，求出Pt（Ⅳ）的竞争性抑制剂常数为3.0×10-6
mol∕L，非竞争性抑制剂常数为7.5×10-6 mol∕L。
图3是在较高的Pt（Ⅳ）浓度（图1中活化区）下酶促反应的L-B图。图中情形类似于混合性抑制[4]，不同之处是在图3中，随着Pt（Ⅳ）浓度的增加，直线的斜率逐渐下降，与混合性抑制的情况正好相反。由于迄今尚无一种合适的机理可用于解释这种实验结果，我们参照酶的抑制作用的处理方法，暂时称之为混合性活化，其双倒数方程为：
1/v0 = 1/ V’max + K’m
/(V’max·[DDBQH2]0)
(1)
K’m 和V’max分别定义为：
K’m
= Km {1+ (Ka/[A0])} /{1+(KA/[A0])}
(2)
V’max
= Vmax /{1+ (KA/[A0])} (3)
其中v0是酶促反应的初速度，Ka和KA可理解为竞争性和非竞争性活化剂常数，[A0]是Pt（Ⅳ）的起始浓度，[DDBQH2]0是底物的起始浓度。图3中各直线的斜率（K’m/V’max）可用式（4）表示：
K’mVmax/KmV’max = 1+ (Ka/[A0])
(4)
图3中各直线的斜率对相应的Pt（Ⅳ）浓度的倒数作图为线性，在横轴上的截距即为-（Ka）-1。从图4（a）可得Ka≈285.7×10-6
mol∕L。
图3中各直线在纵轴上的截距可用式（5）表示：
1/ V’max
= 1/ Vmax + KA / (Vmax·[A0])
(5)
图3中各直线在纵轴上的截距对相应的Pt（Ⅳ）浓度的倒数作图也为线性，在横轴上的截距即为-（KA）-1。从图4（b）可得KA≈62.5×10-6
mol∕L。
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| 图3 Pt（Ⅳ）活化漆酶的L-B图。 [Pt（Ⅳ）]：● 42.4，▲ 62.8，■ 85.6，○ 100.8×10-6 mol∕L。 |
图4 (a) 图3中各直线斜率对[Pt（Ⅳ）]-1图； (b). 图3中各直线在纵轴上的截距对[Pt（Ⅳ）]-1图。Vmax/Km = 0.042 |
2.3 可能的作用位点
图5是Pt（Ⅳ）对漆酶吸收光谱的影响。漆酶的两个特征吸收（614nm和330nm）处[3]的吸光度值均明显降低。从外观看，漆酶液从兰色变为浅绿色。用该酶液进行DDBQH2的催化氧化，发现反应速度明显上升，酶活性比原漆酶提高约25%。
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图5 Pt（Ⅳ）对漆酶吸收光谱的影响。漆酶（220U/ml）：2.0ml。 |
从图5可看出，Pt（Ⅳ）对漆酶的Ⅰ型位（614nm）有一定的影响，但对Ⅲ型位（330nm）的影响更大。Pt（Ⅳ）常以配合物形式存在于络阴离子中，稳定性高，虽然它的离子半径与Cu（Ⅱ）较为接近，但由于Pt（Ⅳ）常形成八面体的空间构型，与Ⅰ型位的变形四面体构型相差较大，因此Pt（Ⅳ）并不一定会置换出漆酶Ⅰ型位中的Cu（Ⅱ），而可能是促进漆酶活性铜部位的重新调整，使其电子通道更加通畅，氧活化功能更易发挥，最终表现为激活作用。
Pt（Ⅳ）对漆酶的作用虽是浓度和时间依赖的，但浓度的影响尤为明显。当Pt（Ⅳ）浓度很小时，可能首先使漆酶的微环境发生一些变化，使其偏离原有构型，因而产生了抑制作用。但当Pt（Ⅳ）浓度超过一定范围时，可以对漆酶的活性铜部位产生影响，迅速表现为激活作用，且这种作用随时间延长而增强。
3 参考文献
[1] Nechay B R, Neldon S L. Cancer Treat Rep, 1984,68:1135
[2] Jennerwein M M, Eastman A, Khokhar A. Chem-Biol Interactions, 1989,70:39
[3] 涂楚桥，梁宏，王光辉. 高等学校化学学报,1999,20(2):243
[4] Sau A K, Mondal M S, Mitra S. J Chem Soc, Chem Commun, 1994,13:1547
涂楚桥 男，30岁，讲师，研究领域：生物无机化学和有机合成化学
** 联系人
广西自然科学基金资助项目(桂科青9743018) 98-12-30收稿，99-05-15修回