Synthesis and Properties of a New Immunoelectrochemiluminescent:
Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2

Wang Peng ,  Zhu Guoyi**
（Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun 130022)

Abstract A novel immunoelectrochemiluminescent probe, Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2 (phen=1,10-phenanthroline, cpaphen=3-carboxy-propan[5-(1,10-phenanthroline)]amide) is designed and synthesized, its chemical structure is also confirmed by means of IR, 1H NMR and ESI-MS. Electrochemical behavior and fluorescence spectrum of Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2 suggest its good hope of being used as a immunoelectrochemiluminescent probe.
Key words Immunoelectrochemiluminescent probe, Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2, Synthesis, Fluorescence, Cyclic voltammetry
摘要 本文合成了新型的免疫电化学发光探针Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2(其中phen＝1，10－邻菲罗啉，cpaphen＝3－羧基丙酰[5－(1，10－邻菲罗啉)]胺)，并用IR、1H NMR、ESI－MS技术确定了其结构。Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2的电化学和荧光行为提示了其作为高效免疫电化学发光探针的良好前景。
关键词 免疫电化学发光探针，Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2，合成，荧光，循环伏安

免疫电化学发光探针Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2的合成及性质

王 鹏 朱果逸**
（中国科学院长春应用化学研究所电分析化学开放实验室，
国家电化学和光谱分析研究中心，长春130022)

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    免疫电化学发光是九十年代才出现的生化分析前沿技术，它已被成功地应用于HIV病毒、O157病毒、沙门氏伤寒菌、促黄体激素、鲑降钙素、肿瘤坏死因子α、向脑神经因子等众多对生命过程有重要作用的物质的测定[1-4]。短短的几年间，这种新技术就已被商业化而广泛应用于临床生化检验，其基础研究也吸引了国内外众多的学者。目前国外使用的免疫电化学发光探针是一种带有四个碳“手臂”的三联吡啶钌(II)配合物，由IGEN公司独家销售，不但价格极其昂贵，且是标记抗体后以试剂盒形式出售[1]。Yang[5]等的研究表明三邻菲罗啉钌(II)与等浓度的三联吡啶钌(II)相比，前者的电化学发光强度是后者的4倍，另外二者的发光波长有明显区别，故当这两种探针同时使用时能采集不同信号对两种组分进行同时测定。为了开拓免疫电化学发光研究的新体系，我们小组设计了新型免疫电化学发光探针Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2 (其中phen＝1，10－邻菲罗啉，cpaphen＝3－羧基丙酰[5－(1，10－邻菲罗啉)]胺)，其合成路线如右图：
1 实验部分
1.1 仪器
    红外测试(KBr压片)在 Bio-Rad 红外光谱仪上进行。核磁测试(以DMSO－d6为溶剂)在Varian Unity-400核磁共振仪上进行。标题分子的质谱测试(DMF为载体)在Finnigan MAT -LCQTM电喷雾质谱仪上进行。循环伏安实验在CHI 660电化学工作站上进行。荧关光谱在Shimadzu RF-5000荧光光谱仪上进行。
1.2 5－硝基－1，10－邻菲罗啉的合成
    5－硝基－1，10－邻菲罗啉参照文献[6]合成。IR cm-1：1517和1345(－NO2)；1H NMR δ ：9.40(d，1H，2－H)，9.35(d，1H，9－H)，9.15(s，1H，6－H)，9.00(d，1H，4－H)，8.89(d，1H，7－H)，8.06(m，2H，3－H和8－H)。
1.3 5－(1，10－邻菲罗啉)胺的合成
    5－(1，10－邻菲罗啉)胺参照文献[7]合成。IR cm-1：3326和3229(－NH2)；1H NMR δ ：9.17(d，1H，9－H)，8.79(m，2H，2－H和7－H)，8.16(d，1H，4－H)，7.85(q，1H，8－H)，7.62(q，1H，3－H)，6.98(s，1H，6－H)，6.27(s，2H，－NH2)。
1.4 3－羧基丙酰[5－(1，10－邻菲罗啉)]胺的合成
    将1.952g(0.01mol)5－氨基－1，10－邻菲罗啉和4.04g(0.04mol)丁二酸酐在100mL无水CH3CN中氩气氛下室温搅拌反应24h。过滤，用少量5％的NaHCO3水溶液洗，再用冷水洗，干燥，得到淡黄色晶体，收率67％。IR cm-1：3447(－OH)，3239(－NH－)，1743和1729(－CO－)；1H NMR δ ：12.36(s，1H，－COOH)，10.34(s，1H，－NH－)，9.24(d，1H，2－H)，9.15(d，1H，9－H)，8.76(d，1H，4－H)，8.57(d，1H，7－H)，8.27(s，1H，6－H)，7.93(q，1H，3－H)，7.86(q，1H，8－H)，2.91(t，2H，－CH2－)，2.74(t，2H，－CH2－)。
1.5 顺式－二氯二(1，10)邻菲罗啉钌(II)的合成
    顺式－二联邻菲罗啉钌(II)的合成和表征参见文献[8]。
1.6 Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2的合成
    0.4791g(0.9mmol)cis-Ru(phen)2Cl2和0.2952g(1mmol)cpaphen在30ml甲醇－水(4:1)中氩气氛下磁力搅拌回流8h。反应液在冰水浴中冷却1.5h。过滤，用10ml甲醇洗。滤液中加入25ml含有6.0gNaPF6的水溶液，搅拌，在冰水浴中冷却3h。过滤，冷水洗得到粗产品。反应粗产物在丙酮和乙酸乙酯(1:1)中重结晶，得到橙红色晶体，收率79％。IR cm-1：3405(－NH－和－OH)，1730和1719(－CO－)；1H NMR δ ：12.33(s，1H，－COOH)，10.66(s，1H，－NH－)，8.90(m，6H，phen与cpaphen的4－H和7－H)，8.77(s，1H，cpaphen的6－H)，8.51(s，4H，phen的5－H和6－H)，8.21(m，6H，phen与cpaphen的2－H和9－H)，7.89(m，6H，phen与cpaphen的3－H和与8－H)，2.96(t，2H，－CH2－)，2.75(t，2H，－CH2－)；ESI－MS(m/z)：901.6([M－PF6]+)，378.3([M－2PF6]+)。
2 结果与讨论
2.1 Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2的电化学行为
    Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2在CH3CN中的循环伏安实验表明其阳极峰电位和阴极峰电位分别为1.308V和1.244V(相对于饱和甘汞电极)，它的氧化电位适于免疫电化学发光分析[1]。
2.2 Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2的荧光光谱
    Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2饱和水溶液的最大激发波长为310nm、382nm和448nm，它们的最大荧光发射波长均为584nm，且有相同的荧光发射光谱，发射峰相比IGEN公司[1]的免疫电化学发光探针(λmax＝620nm)蓝移了36nm，这将有利于两种探针配合使用进行两组分的免疫分析。Bard小组[9]在电化学发光领域的大量工作表明电化学发光物质的荧光光谱与电化学发光谱一致，故本文未测定Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2的电化学发光谱。
    Ru(phen)2(cpaphen)(PF6)2用于免疫电化学发光分析的工作正在进行中。
3 参考文献
[1] Blackburn G F, Shah H P, Kenten J H, et al. Electrochemiluminescence detection for development of immunoassays and DNA probe assays for clinical diagnostics. Clin. Chem., 1991, 37: 1534-1539
[2] Deaver D R. Anew non-isotopic detection system for immunoassys. Nature, 1995, 377: 758-760
[3] Moreau E, Philippe J, Couvent S, et al. Interference of soluble TNF-α receptors in immunological detection of tumor necrosis factor-?. Clin. Chem., 1996, 42(9):1450-1453
[4] Ma Y T, Hsieh T, Forbes M E, et al. BDNF injected into the superior colliculus reduces developmental retinal ganglion cell death. J. Neurosci., 1998, 18(6): 2097-2107
[5] Yang H J, Gudibande S R. Electrochemiluminescent metal chelate labels and means for detection. PCT WO 96/35697, 1996, 20-21
[6] Smith G F, Jr F W C. The improved synthesis of 5-nitro-1,10-phenanthroline. J. Org. Chem., 1947, 12: 781-783
[7] Lecomte J P, Mesmaeker A K D, Demeunynck M. Synthesis and characterisation of a new DNA-binding bifunctional ruthenium(II) complex. J. Chem. Soc. Farady Trans., 1993: 89(17): 3261-3269
[8] 王 鹏, 朱果逸, 吴亦洁. 两种Ru(II)配合物的二维核磁共振氢谱分析. 分析化学, 1998, 26(12): 1474
[9]  Lee S K, Richter M M, Bard A J, et al. Near-IR electrogenerated chemiluminescence, electrochemistry, and spectroscopic properties of a heptamethine cyanine dye in MeCN. Anal. Chem., 1997, 69: 4126-4

王鹏 男，24岁，博士研究生，从事电化学发光免疫分析和核酸杂交分析；
朱果逸 研究员，博士生导师。**联系人
本文系国家“九五”攻关重点项目资助。