Study on Process of Two-Step Extraction of Effective Components from Plant Material with Solvent afterwards Enzyme and of Membrane Separation of Extracted Liquid

Xue Weiming，  Zhang Xiaolin，   Kang Maode
(Chemical Engineering Department of Northwest University, Xi'an  710069)

Abstract A new two-step extracting technology of effective components from plant material with solvent afterwards enzyme is developed. With cellulase and glullase,the structural ingredients of plant material,such as cellulose,glullose etc., are decomposed resulting in decreasing resistance of mass transfer for effective components and increasing its extracting rate.The residue from enzyme-based step can be further extracted in the second solvent-based step by selecting proper solvent in order to extract effective component sufficiently. The optimum parameters of the two-step extracting technology are determined experimentally.The extracted liquid is separated with cellulose acetate-titanium composite ultrafiltration membrane(CATiUFM). The influences of different factors on membrane separation process are studied experimentally. The mass transfer model of membrane separation is discussed and then set up.
Key words cellulase,  glullase,  effective components of plant,two-step extraction, membrane, ultrafiltration, mass transfer model
摘  要 提出了植物有效成分提取的酶-溶剂二步法提取新工艺，利用纤维素酶、果胶酶对植物材料结构成分（如纤维素、果胶等）进行降解，减小有效成分传质阻力，提高有效成分提取率。通过选择适宜溶剂，对一步酶法提取阶段所得渣质进行二步溶剂提取，达到充分提取有效成分的目的。实验确定了酶-溶剂二步法提取工艺参数。应用自制二醋酸纤维素-钛复合超滤膜（CATiUFM）对植物有效成分提取液进行膜法分离精制，实验研究了不同因素对膜分离过程的影响。探讨并建立了植物有效成分提取液膜分离过程传质模型。
关键词 纤维素酶 果胶酶  二步法提取 膜 超滤 传质模型

植物有效成分的酶-溶剂二步法提取及膜分离过程研究

薛伟明  张效林  亢茂德
（西北大学化工系，西安  710069）  

    在植物有效成分提取过程中，存在于植物细胞中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。由于细胞壁及细胞间质的主要化学成分是纤维素、果胶等物质，本文采用对纤维素、果胶具有专一降解作用的纤维素酶、果胶酶作用于植物材料，使纤维素、果胶等物质降解，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从细胞内向提取介质扩散的传质阻力，从传质角度促进有效成分提取率提高^[1]。
    当一步酶法提取达到提取平衡后，选择适宜溶剂对提取液中的渣质进行二步溶剂提取。通过建立新的溶解扩散平衡，充分提取渣质中残留的有效成分。酶-溶剂二步法提取工艺不仅可以分步提取植物材料中溶解性能差异较大的有效成分，而且通过酶对植物材料的降解作用，提高有效成分提取率，充分利用植物资源。该工艺特别适用于具有较高经济附加值的植物有效成分提取过程。
    在植物有效成分提取液中，含有大量植物蛋白、鞣质、淀粉、菌体等常规过滤未能除去的杂质，它们会严重影响提取液的贮存稳定性和产品品质。本文应用自行开发的二醋酸纤维素-钛复合超滤膜（CATiUFM)技术^[2]，针对不同物系提取液的特点，制备具有适宜性能的CATiUFM，对提取液除杂精制。由于CATiUFM膜法分离过程在常温操作，分离过程无相变，无需外加试剂，确保了有效成分理化性质的稳定性及其天然特征，因而特别适用于天然植物提取液体系的分离、纯化和精制。 本文以红花、侧柏叶为研究对象，进行植物有效成分酶-溶剂二步法提取及膜分离过程研究。
1 实验
1.1 主要实验设备、仪器与材料
    76-1型恒温水浴，WMZK-01型温度控制仪，6511型搅拌器，DDS-11A型电导率仪，722型分光光度计，管式膜超滤装置(自制),纤维素酶(CE1、CE2：陕西临潼纤维素酶研究基地提供；CE3：山东大学微生物研究所；CE4：上海丽珠东风生物技术有限公司），果胶酶(江苏无锡酶制剂厂),鞣酸(A.R),芦丁(中国药品生物制品检定所),红花黄色素(自制），二醋酸纤维素（结合酸55.3%～55.5%），所用其他试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 一步酶法提取:将适量待提取植物材料、蒸馏水、酶加入提取釜，调节提取介质pH值，搅拌状态下恒温提取。定时取样，经自制二醋酸纤维素微滤膜（CAMFM）除杂纯化后，于30℃恒温测定提取液样品的电导率值，并辅以分光光度法进行有效成分含量分析。提取结束后，抽滤。滤液送至超滤工序膜法精制，渣质送至溶剂提取工序进行二步提取。
1.2.2 二步溶剂提取：采用适宜溶剂对1.2.1中所得渣质进行二步提取,分析方法同1.2.1。提取结束后，抽滤。根据提取液中溶剂与有效成分的特点，将滤液或与1.2.1中滤液合并，或单独送至超滤工序膜法精制。
1.2.3 提取液膜法分离精制：采用自制CATiUFM及超滤装置，对提取液膜法分离精制。考察不同操作条件对膜法分离过程的影响，确定适宜的操作参数。
1.2.4  分析方法
1.2.4.1膜纯化-电导率测定法
    在提取过程中，植物材料中的有机酸、生物碱、无机盐等荷电物质向提取介质扩散，并在外加电场作用下使提取介质显示电信号。利用这一特征，本文采用电导率测定法作为快速、动态、定量地反馈提取过程信号的基本分析方法^[3]，对提取过程进行快速、实时或在线监控，并为研究提取过程传质规律、建立传质模型提供基本数据。
    由于提取液中含有植物蛋白、鞣质等大分子物质，它们对荷电物质在电导电极间的定向迁移具有碰撞、吸附、位阻等效应，导致电导率测定值偏低。另外，提取液中大量悬浮微粒亦会强化这种干扰作用。本文采用自制二醋酸纤维素微滤膜（CAMFM）对提取液中的大分子杂质和悬浮微粒除杂纯化，消除它们对电导率测定的干扰，取得了满意效果。CAMFM膜法纯化分析技术具有操作简便、除杂效率高、纯化分析过程无相变、有效成分损失小、分析精度较高等特点，体现了膜分离技术在分析科学领域中应用的重要意义。

1.2.4.2 红花黄色素、侧柏叶总黄酮含量分别采用文献[4,5]方法测定。纤维素酶滤纸酶活力采用文献[6]方法测定。鞣质含量采用文献[7]方法测定。 2 结果与讨论 2.1 植物有效成分酶法提取过程研究 2.1.1纤维素酶对植物有效成分提取过程的影响      以红花、侧柏叶为提取材料，分别提取其中的有效成分红花黄色素、侧柏叶总黄酮。纤维素酶对红花、侧柏叶有效成分提取过程的影响如图1所示。电导率值与有效成分含量测定结果均表明，与对照样品相比，纤维素酶对红花、侧柏叶有效成分提取具有促进作用，提取率分别提高13.6%和10.8% 。 2.1.2与提取系统匹配的纤维素酶的筛选     本文测定了四种不同来源纤维素酶的滤纸酶活力，并考察了它们对红花提取过程的影响，结果如表1所示。结果表明，CE3的滤纸酶活力最高，但在红花提取系统中，采用CE4却得到了最佳提取效果。
	图1 纤维素酶对红花、侧柏叶有效成分提取过程的影响

纤维素酶

CE1

 CE2

CE3

CE4

滤纸酶活力
μmol·g-1.min-1

635.8

470.0

976.5

846.5

红花黄色素含量
mg·ml-1

22.17

21.54

23.18

23.87

    在纤维素酶制剂中，除主要成分纤维素酶之外，还含有少量半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等。当测定纤维素酶滤纸酶活力时，酶对底物作用的专一性使测定结果只显示酶制剂中纤维素酶的催化活性。由于植物材料中不仅含有纤维素，还含有半纤维素、果胶、蛋白质等物质，在酶法提取过程中，纤维素酶制剂中的半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等由于底物的存在也同时显示催化活性。与纤维素酶的单一催化作用相比，这种协同催化效应能更有效地减小有效成分从植物细胞内向提取介质扩散的传质阻力。在酶法提取过程中，有效成分提取率的高低不仅与酶制剂中纤维素酶的含量、活力有关，也与酶制剂中半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等的含量、活力有关。因此，应对不同来源的纤维素酶制剂进行筛选，以获得与提取系统匹配的、具有最大提取效率的纤维素酶制剂。
2.1.3提取条件对植物有效成分酶法提取过程的影响
    图2～图5为不同提取条件对红花、侧柏叶有效成分提取过程的影响。结果表明，红花、侧柏叶有效成分酶法提取适宜工艺参数为：T=50℃，pH=4.4，r=1000r ·min^-1， G_红花:G_纤维素酶 =80:1，G_侧柏叶:G_纤维素酶 = 75:1。

图2 提取温度对红花、侧柏叶有效成分酶法提取过程的影响		图3 提取介质pH值对红花、侧柏叶有效成分提取过程的影响
图4 搅拌状态对红花、侧柏叶有效成分提取过程的影响		图5 纤维素酶用量对红花、侧柏叶有效成分提取过程的影响

2.1.4 果胶酶-纤维素酶协同催化作用对植物有效成分提取过程的影响 

图6 双酶法与单酶法对红花有效成分提取过程的影响

    将果胶酶加入红花--纤维素酶提取体系进行红花有效成分提取，结果如图6所示。可见，与仅含有纤维素酶的对照体系相比，果胶酶--纤维素酶双酶体系的提取率明显提高。这是由于果胶酶可降解植物细胞壁及细胞间质中的果胶，强化了纤维素酶的破壁作用。同时，果胶酶还可降解提取液中的果胶，使提取液粘度降低，增大了有效成分的扩散系数。因此，双酶法具有破壁、降粘的双重作用，利于植物有效成分提取率的提高。
2.2植物有效成分酶-溶剂二步法提取过程研究
2.2.1 酶-溶剂二步法提取工艺与一步法提取工艺提取率的比较
    当提取材料量M(g)、提取溶剂量V(ml)、提取时间t(h)一定时，考察一步法、二步法提取工艺对红花黄色素、侧柏叶总黄酮提取率的影响，结果如表2所示。本文将有效成分提取率定义为：

    由表2可见，与一步酶法或一步溶剂提取工艺相比，酶-溶剂二步法提取工艺所得有效成分提取率明显提高。一方面，在酶法提取基础上，采用适宜溶剂可进一步提取在酶法提取阶段残留的有效成分；另一方面，酶法提取阶段对植物材料的降解作用，也提高了溶剂提取阶段有效成分的提取率，此二阶段的相互促进作用导致酶-溶剂二步法提取工艺所得有效成分提取率较高。

2.2.2溶剂提取阶段工艺参数的确定
    由于侧柏叶总黄酮在乙醇溶液中溶解性优于在水中溶解性,因而在侧柏叶有效成分酶-溶剂二步法提取过程中，采用乙醇溶液进行二步溶剂提取。提取温度、乙醇溶液浓度对溶剂提取过程的影响如图7、图8所示。图7表明，侧柏叶有效成分提取率随温度升高而增大，但当T>50℃ 时，提取率增加速率降低，故采用T = 50℃为适宜提取温度。图8表明，当乙醇溶液浓度C = 50～60（vol)%，提取液中侧柏叶总黄酮含量具有极大值，故确定适宜的乙醇溶液浓度C =50(vol)% 。

图7 提取温度对侧柏叶有效成分乙醇-水提取过程的影响		图8 乙醇浓度对侧柏叶有效成分乙醇-水提取过程的影响

2.3 植物有效成分提取液膜法分离精制过程研究
2.3.1 CATiUFM的制备及膜性能参数的测定

膜纯水通量J，
ml.cm-2.min-1
(ΔP = 0.3MPa)	

膜平均孔径r,μm

0.063

0.047

0.087

0.072

鞣酸截留率R,(%)

82.0

84.3

73.0

76.9

    以CA为膜材料，按一定配比与溶剂、添加剂配制铸膜液，采用旋转刮膜法制备CATiUFM。在自制管式膜超滤装置上测定膜纯水通量J及膜平均孔径r，以鞣质作为提取液中大分子杂质的代表物，测定膜对鞣质的截留率R。结果如表3所示，据此筛选既有适宜通量，对鞣质又有较高截留率的1^#膜作为提取液膜法精制用膜。
2.3.2 纤维素酶对CATiUFM稳定性的影响
    自提取工序所得提取液中，含有仍具有一定残留活性的纤维素酶。为了考察纤维素酶对CATiUFM膜性能的影响，将CATiUFM浸泡于C=2.0mg.ml^-1的纤维素酶溶液中，定时测定其纯水通量及对鞣质的截留率，结果如表4所示。可见，经纤维素酶溶液长时间浸泡，CATiUFM的纯水通量及其对鞣质截留率无明显变化，表明纤维素酶对CATiUFM膜性能稳定性基本无影响，CATiUFM适于酶法提取工艺所得提取液的膜法精制。

2.3.3 超滤压差ΔP对提取液膜分离过程的影响
　　图9为超滤压差ΔP对红花提取液膜分离过程的影响。结果表明，ΔP对红花提取液膜通量J的影响分为三个阶段:在较低压差范围内，J随ΔP呈线性增加；随着ΔP增大，膜面浓差极化趋于严重，J的增加速率降低；当ΔP继续增大，提取液中大分子物质开始在膜面聚集并形成凝胶层，此时膜面溶质浓度为凝胶浓度Cg，与之对应的ΔP为超滤临界压差ΔPc，此后，增大ΔP只能增加膜面凝胶层厚度，而J不再随ΔP变化。对侧柏叶提取液膜法分离也得到了相同结果。可见，适宜的ΔP应控制在将达到而未达到ΔPc，故红花提取液的适宜超滤压差ΔP=0.25～0.35MPa。
     图9还表明，随ΔP增大，CATiUFM对红花提取液中鞣质的截留率R提高。这是由于增大ΔP，不仅引起膜孔结构的压实效应，还引起提取液中大分子物质在膜面聚集及"架桥"现象，导致R提高。但当ΔP>0.3MPa时，R变化不大。结合膜通量实验结果，确定红花提取液膜分离的适宜ΔP=0.3 MPa 。

图9　超滤压差ΔP对红花提取液膜分离过程的影响		图10.膜面流速对红花提取液膜法分离过程的影响

2.3.4 膜面料液流速对提取液膜法分离过程的影响
　　膜面料液流速对红花提取液超滤过程的影响如图10所示。结果表明，增大膜面料液流速，可提高提取液的膜通量J。根据超滤过程浓差极化模型：

式中：J—膜体积通量，k—超滤传质系数，C_m—料液侧膜面溶质浓度，C_b—料液主体溶液中溶质浓度, C_p—透过液中溶质浓度,D—溶质在溶剂中的扩散系数,δ—膜面浓差极化边界层厚度。
    可见，提高膜面料液流速，料液湍动状态较好，利于减小膜面浓差极化层厚度δ，增大超滤过程传质系数k，使提取液膜通量J提高。
2.3.5 提取液浓度对膜法分离过程的影响
    提取液浓度Cb以单位体积提取液所含提取材料质量表示。图11为红花提取液浓度C_b与膜体积通量J、膜质量通量J_e、膜透过液中红花黄色素含量C_p之间的关系。结果表明,J随C_b增大而下降，C_p随C_b增大而增大。由于J_e=J×C_p,J与C_p的相互消长作用使J_e在C_b=12g/L时具极大值。因此红花提取液CATiUFM膜法超滤的适宜浓度Cb=12g·L。

图11 提取液浓度对红花提取液膜法分离过程的影响		图12 提取液温度对红花提取液膜法分离过程的影响

2.3.6提取液进料温度对膜法分离过程的影响
    图12为提取液进料温度对膜法分离过程的影响。结果表明，料液温度升高，提取液膜通量增大。
     超滤传质系数k与料液温度T之间有如下关系^[8]：
         k∝exp (0.005T)  (3)
    而料液粘度h与温度T之间符合Andrade关系式：
         h = A exp^B/T       (4)
　　且　 h D/T = 常数        (5)
    可见，提高提取液进料温度T，可降低液体粘度h，增大溶质扩散系数D及超滤传质系数k。这样不仅降低了提取液透过膜孔的流动阻力，而且增大了被截留溶质由膜面边界层向主体溶液方向的反相扩散通量，减弱了浓差极化的不利影响。因此，提高提取液温度利于超滤过程的进行。为了保持有效成分的天然活性，提取液进料温度以40～50℃为宜。
3 植物提取液超滤过程传质模型
    预测超滤过程渗透通量的传质模型主要有浓差极化模型、凝胶极化模型、串联阻力模型等。由于植物提取液超滤体系组成复杂，超滤过程物性数据测定困难，阻碍了上述模型的实际应用。作者认为，Ho-Ming Yah 针对葡聚糖T500中空纤维膜超滤过程提出的修正凝胶极化模型^[9]可推广应用于植物提取液超滤体系，其中，
(6)
    R=R_m+R_f            (7)
    R_p=ΔP/J_{lim        (8)}
式中，J_lim—超滤极限通量，R_m—本征膜阻力， R_f—由吸附和污染引起的阻力，R_p—由浓差极化或凝胶层引起的阻力。
    当超滤器形式及提取液体系一定时，模型参数R、J_lim是料液流速和浓度的函数，可通过对实验数据线性回归求得。以侧柏叶提取液CATiUFM超滤过程为例，作者建立了该体系超滤过程的修正凝胶极化模型^[10]：

(9)
式中，C0为侧柏液提取液中被截留杂质叶绿素的料液浓度。该模型适用于整个超滤压差范围，模型计算值与实验值吻合良好，最大误差为7.1%。
4 结论
（1）以红花、侧柏叶有效成分提取过程为研究对象，提出了新工艺。其中，利用纤维素酶、果胶酶进行植物有效成分酶法提取为本研究首创。与对照体系相比，红花、侧柏叶有效成分酶法提取率分别提高13.6%、10.8%。
（2）酶-溶剂二步法提取工艺参数：红花、侧柏叶提取体系的酶法提取适宜条件 ：T = 50 ℃，pH = 4.4, r = 1000 r·min, G_红花:G_纤维素酶= 80:1，G_侧柏叶:G_纤维素酶= 75:1。侧柏叶体系溶剂提取适宜条件:T=50℃，C_乙醇=50（vol)%。
（3）通过筛选自制CATiUFM，进行植物有效成分提取液膜法精制。提取液中残留的纤维素酶对CATiUFM膜性能无显著影响。红花提取液膜法分离精制的适宜操作参数为：ΔP=0.3MPa，提取液进料浓度C_b= 12g·L，提取液进料温度T=40～50℃，料液膜面流速ν=2m·s。
（4）对提取液膜法分离过程传质模型进行了探讨，建立了侧柏叶提取液膜法分离过程的传质模型。
5 参考文献
[1] 薛伟明，张效林，亢茂德等.西北大学学报，1997，（6）：494～498
[2] 亢茂德，张效林等.膜分离科学与技术，1982,2(4):35
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[4] 中华人民共和国药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）.北京：化学工业出版社，人民卫生出版社，1995：418～423
[5] 程立方，田樱.时珍国药研究，1995，6（4）：15～17
[6] 张树正等著.酶制剂工业.北京：科学出版社，1984：596
[7] 程立方，田樱.时珍国药研究，1995，6（3）：13
[8] Agrawal J P,Sourirajan S. Ind.Eng.Chem.Process Pes.Develop.,1969,(8):439
[9] Yeh H M. Separation Science and Technology ,
1996, 31 ( 2 ) : 201
[10] 张效林，薛伟明，王康等.化学工程，1998，26（4）

1998-06-30收稿；国家自然科学基金资助项目