Development of Coupling of Capillary Electrophoresis and Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry

Yuan Zhuobin, Zhang Shusheng, Zhu Min

Abstract This review presents the basic principle of matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOFMS) and the development in coupling of capillary electrophoresis(CE) and MALDI-TOFMS 20 references are cited.
Key words Capillary electrophoresis,Matrix assisted laser desorption/ionization, Time of flight mass spectrometry,Coupling
摘要 阐述了基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)的基本原理，对毛细管电泳和MALDI-TOFMS的联用技术的研究进展进行了评述。引用参考文献20篇。
关键词 毛细管电泳 基体辅助激光解吸/电离 飞行时间质谱 联用

毛细管电泳和基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱联用技术研究进展

袁倬斌 张书胜 朱敏
(中国科学技术大学研究生院化学部 北京 100039)

毛细管电泳(CE)是极有力的液相分离技术之一，广泛用于多个领域。由于CE的进样量小，通常在nl级，所以对CE的检测器的要求非常高，即高灵敏、快响应、高分辨。目前有光学、电化学、放射性和质谱等检测方法。在CE的所有检测器中，质谱(MS)是唯一能提供分析物结构和分子量信息的检测器。1995年，Cai等[1]对CE与四极滤质、离子阱和傅利叶变换离子回旋共振MS联用技术进行了评述，指出这些质量分析器在获得一张完整质谱图需要较长的时间(0.1-2s)，对CE馏分无法作出快速响应。而飞行时间质谱(TOFMS)完成同样的任务仅需0.1-0.2ms[2,3]，同时还具有分析质量范围宽、离子传送效率高、灵敏度高和高效能循环(high duty cycle)等优点，使其成为CE检测器的最佳选择[4]。目前多采用电喷雾(ES)和连续流体快原子轰击(CFFAB)作为CE和TOFMS的接口[5,6]，这两种接口容易实现在线联接。尽管ES电离具有高电离效率、软电离、产生多电荷等优点，但是对于未知的混合物，每一个分析物质多重峰的存在，不仅使数据解析复杂化，而且使检测灵敏度降低。基体辅助激光解吸/电离(MALDI)是一种新的“软电离”技术，特别适于极性大、难挥发、难气化的生物大分子的电离，CE-MALDI-TOFMS正在成为CE技术的前沿课题之一，现在就其研究现状进行评述。
1 MALDI-TOFMS 的基本原理
与四极、离子阱和磁质谱不同，TOFMS记录的是离子化的样品离子从离子源到达检测器的飞行时间(图1为线性TOFMS的原理图)。因TOFMS具备内在的高效能循环（high duty cycle），记录的是漂移时间，所以适于质量动态范围大的样品分析。其测定原理比较简单，样品经离子源离子化后，离子(质量为m,电荷为z)在电场(电压为V,长度为d)的加速下，通过漂移区(长度为L)后到达靶平面(检测器)而被检测。样品离子的飞行时间T

加速区 自由漂移区 检测区
图 1 MALDI-TOFMS 示意图
为其在加速场和漂移场中的飞行时间之和，即： T=d(2m/Vze)1/2+L(m/2Vze)1/2 (1) 或 (m/z)1/2= aT+b (2)

MALDI采用短激光脉冲(1-10ns)使样品分子离子化。样品和基体的混合物(1:1000-1:5000)被置于样品探头上，在激光作用下，基体对激光有较强的吸收而被激发、蒸发，而样品分子对激光仅有弱吸收，基体将样品带入气相。同时样品与激发态的基体间发生酸碱(M-H+,M+H+)反应，产生离子。早期，没有使用基体的激光解吸，激光使高分子分解，产生多种碎片。在引入基体之后，则解决了大分子的气化问题。MALDI采用的激光波长通常为337nm和10.6m m，激光功率通常为5-20W，但仅有10-4W 的能量用于样品的解吸和离子化，样品的分解几率减小。MALDI的基体应具有光吸收性、可溶性和低的反应活性[7]，许多具有共轭结构的芳香化合物很容易满足这一要求，如2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、a-CN-4-OH-肉桂酸(ACHC)[8]等。
2 CE 和MALDI-TOFMS联用技术
2.1 CE与MADLI-TOFMS 离线联用技术及其应用
在1992年Keough等[9]报道的离线联用技术中，MADLI样品的制备方法如下：(1)CE馏分+0.1%三氟乙酸(TFA)->1-2mmol/L样品溶液A；(2)10mg 芥子酸(SA)＋1ml(30%CH3CN/0.1%TFA,1:1)->SA基体溶液B；(3)1-2mlA+1-2mlB->溶液C；(4)1-2mlC加到MALDI的探针上，室温干燥，送入MALDI-TOFMS分析。作者采用355nm的激光(脉冲频率10Hz)、35kV二级加速和2 m漂移管成功分离分析了牛-a-乳白蛋白和马心肌红蛋白。1995年Foret等[10]采用“套液”方式将由毛细管等电聚焦分离出的肌红蛋白、b -乳白蛋白A、碳酸酐酶I和II收集在60支20ml的毛细管中，取2mlCE样品收集馏分置于MALDI探头，溶剂挥发后，再在探头上点2m l的SA基体的饱和溶液(0.1M TFA/CH3CN,6:4)，干燥形成晶体后，送入MALDI, 采用N2激光(337nm)解吸离子化，进行TOFMS分析。与前种方法不同，Walker等[11]将CE馏分直接滴加到MALDI的探头上，挥发后再加入基体2,5-二羟基苯甲酸(DHB)，并采用337nmN2激光解吸/离子化TOFMS分离分析了细胞色素c，灵敏度达到25 fmole。1997年Cohen等[12]采用3-羟基吡啶羧酸(3-HPA)和N-(3-吲哚乙酰基)-L-亮氨酸(IAL)混合基体，将样品和基体溶液经NH4+阳离子交换树脂处理后(除去碱金属离子)点到MALDI不锈钢探头上，用N2激光(337nm)成功地进行了低聚核苷酸(GEM 91)代谢物的CE-TOFMS分析，并同时与CE-激光诱导荧光(CE-LIF)的分析结果进行了比较。Suzuki等[13]用NH4+阳离子交换树脂二次处理3-HPA 和6-HPA的混合基体，CE馏分直接收集在MALDI探头上，在45℃干燥5分钟后，再将基体混合物加在探头上。作者采用337nmN2激光解吸/离子化后获得了1-氨基芘-三磺酸基寡聚糖(APTFO)的TOFMS分析结果，同时比较了不同基体如DHB 和CHCA对MS的信噪比、灵敏度的影响，表明3-HPA和6-HPA混合基体的效果比较理想。Chakel等[14]采用预盛装有5ml水的毛细管接收CE馏分，将SA基体和CE样品馏分混合后取2ml点在MALDI探头上，室温干燥后进行MALDI-TOFMS分析。作者分析了DNA衍生化糖蛋白，如卵白蛋白和唾液纤维蛋白溶酶原激活剂(DSPA a 1)的组成和分子量。Mcleod等[15]采用MECC-MALDI-TOFMS离线分离测定了蛋氨酸脑啡肽。作者是将CE馏分接收在MALDI探头的样品井(预加基体)内，比较了直接干燥制备基体和电喷雾制备基体对TOFMS分析的信噪比和灵敏度的影响，结果表明后者的灵敏度是前者的1-2倍。实验采用的是CHCA基体和337nmN2激光。同时还讨论了MECC缓冲液中十二烷基硫酸钠(SDS)对MS结果的影响。图2是CE馏分的接收器。

图2 CE 馏分接收示意图 1-毛细管, 2-缓冲液, 3-折口, 4-离子多孔接头, 5-液滴, 6-CE地电极, 7-MALDI探头

总之，CE与MALDI离线接口既要保证CE的分离效率，又要保证在MALDI靶上重复点样，此外还要考虑在耦合过程中产生的记忆效应。
2.2 CE 与MALDI-TOFMS 在线联用技术及其应用
在CE与MALDI-TOFMS 离线联用技术中，样品接收、样品与基体的混合、晶体的形成等步骤都关系到MALDI-TOFMS分析结果的灵敏度和分辨率，而且整个分析过程费时繁琐。因而人们从一开始就致力于CE与MALDI-TOFMS 在线联用技术的研究与开发，但是就如何在线获得样品和基体的混合物，以及该混合物经在线处理后适合MALDI-TOFMS分析这个问题一直未得到很好的解决，因此CE与MALDI-TOFMS 在线联用技术的研究成果较少。
Li等[16]受连续流体快原子轰击电离在流体中加入底物的启发，在流体中加入基体3-硝基苯乙醇，并在毛细管出口端套上一不锈钢网后，置于MALDI-TOFMS的排斥极和离子抽取极之间，设计出了连续流体MALDI-TOFMS接口，用266nm的激光辐射，完成了肌红蛋白的流动注射MALDI-TOFMS分析。1995年Li等[17]对上述接口又进行了改进，去掉了毛细管末端的不锈钢网，实现了液相色谱MALDI-TOFMS在线联用。Murray等[18,19]制作了流体气溶胶MALDI-TOFMS 在线接口技术，允许流速高达0.5ml/min。
美国Iowa州立大学杨士诚教授等[20]最近设计了一种新型、简单的连续液流CE与MALDI-TOFMS在线联用接口(见图3) 。利用该接口技术，作者成功地克服了因MALDI-TOFMS内的高真空引起的CE的层流及扰动，使CE流速处于正常水平(2-3nl/s)，从而减少CE分离效率降低的可能性。作者在缓冲液中直接加入了基体如CuCl2(并与DHB进行了比较)，采用248nm的紫外激光获得了色胺、5-羟基色胺和一些肽(Val-Leu、Phy-Gly、Val-Phe)的CE-MALDI-TOFMS分析结果。同时讨论了CE阳极室压力、CE流速、碱金属离子(Na+、K+)对分析结果的影响。

图 3 CE-MALDI-TOFMS 示意图 1-真空泵, 2-CE 高压电源, 3-毛细管, 4-玻璃棒, 5-密封垫, 6-漂移区,7-样品盒, 8-棱镜, 9-反射镜, 10-激光器

CE与MALDI在线接口既要考虑如何在CE的馏分中加入MALDI的辅助基体，又要考虑质谱仪负压对CE的分离效率的影响，因此CE与MALDI-TOFMS在线联用难度较大。
3 展望
MALDI是一种新的“软电离”技术，在1997年美国科学信息研究所(ISI)公布的化学学科十大前沿课题中，MALDI名列其中。MALDI-TOFMS 特别适于生物大分子的质谱分析，如果实现CE与其联用，必将拓宽CE和MS的应用领域，特别是在分子生物学、医学、药学和食品科学领域中会大显身手。目前在仪器和方法学上仍需解决以下问题：(1)真正解决CE与MALDI-TOFMS的在线耦合接口；(2)搞清MALDI的基体辅助机理，寻找具有普适性的基体；(3)从本质上提高TOFMS的分辨率；(4)研究建立适合DNA序列和肽图分析的通用方法，建立数据库。
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袁倬斌 男，60岁，教授，博士生导师，主要从事电分析化学、有机极谱学、生物医学等研究
1998-04-13 收稿，1998-09-20修回；国家“九五”和河南省科技攻关项目