Research of Ligninolytic Enzymes’ Production of Alkaliphilic Ligninolytic Bacteria Guan Xiaowu Zhang Jiayao Luo Yuxuan Li Jing Ma Ying (Department of Environmental Science, Wuhan University 430072) Abstract The article research ligninolytic enzymes production and activities of alkaliphilic ligninolytic bacteria in alkaline liquid medium(pH≈10.5) with various carbons or nitrogen and various ratio of carbons and nitrogen. Klason-lignin takes advantage of production of MnP, the activity is 283.50U/L, but LiP and Laccase don’t detected. The activities of Laccase and MnP are higher in sugar cultivation condition, their activities are 245.42U/L and 122.52U/L respectively. And their activities are 628.03U/L(4days) and 129.76U/L(8days) respectively at optimal cultivation times. Lower carbon medium is suitable for production, and low nitrogen medium restrain obviously synthesis of the enzymes. Key words Alkaliphilic bacteria，Ligninolytic enzyems，Laccase，Lignin peroxidase，Mn(II)-dependent peroxidase 摘要 本文研究了在不同碳源和氮源以及不同碳氮比的碱性液体培养条件(pH≈10.5)下，嗜碱木素降解菌所产生的木素降解酶的种类和产酶能力。结果表明，Klason木质素有利于MnP的产生，活性达283.50U/L，但在此条件下不产生LiP和Laccase；而蔗糖条件下产生的降解酶Laccase和MnP活性最高，分别为245.42U/L和122.52U/L，而在最佳产酶培养时间它们的活性达到628.03U/L(4天)和129.76U/L(8天)。碳源限制有利于酶的产生，而氮源限制则明显地抑制了酶的合成，且后者对菌株的产酶能力影响较大。 关键词 嗜碱性细菌 木素降解酶 虫漆酶 木质素过氧化物酶 锰依赖过氧化物酶 嗜碱木素降解菌产酶条件的研究* 管筱武 张甲耀** 罗宇煊 李静 马英 (武汉大学环境科学系 430072) 木质素是由苯丙烷类似物为单元构成的一大类生物多聚体，组成单元的结构及其连接键复杂而稳定，难于降解，且木质素与纤维素和半纤维素的结合非常紧密，从而阻碍了对纤维素和半纤维素的利用。在造纸工业中，木质素的降解与去除主要是通过热碱处理等化学方法，这不仅需要消耗大量的化学药品和能源，所产生的制浆废液还造成了严重的环境污染问题。尤其是我国森林资源缺乏，多以麦草等草类为造纸制浆原料，带来了更为严重的环境污染问题。随着生物技术的进步，人们已开始将木质素降解微生物和木质素降解酶对木质素的降解能力应用于生物制浆和漂白以减少污染。近年来，某些木质素降解微生物已开始应用于工业生产和环境处理。如黄孢原毛平革菌和P.brevispora等白腐真菌已成功地应用于造纸工业中的生物制浆、生物漂白等过程。用P.brevispora进行生物制浆预处理降低了47%的能耗，并增加了纸浆的张力[1]。目前，对木质素的降解作用效果好、产酶活性高的微生物主要是某些白腐霉。但它们的木质素降解率和产酶量都还是极为有限的，在应用中还存在着处理时间过长等诸多矛盾，距实际大规模的应用仍有极大的差距。而细菌具有生长较快的特点，利用嗜碱性细菌降解木质素，则可结合有利于降解木质素的化学特性(木质素在一定程度上可溶于碱性溶液)和生物特性。八九十年代的研究工作表明细菌可以降解代谢杨木二氧已烷木质素和低分子量的硫化木质素(lignosulfonates)及Kraft木质素的片断[2]。我们通过研究嗜碱木素降解菌菌株的木素降解能力和产酶能力，找到了一株具有较高木素降解能力和木素降解酶活性的嗜碱木素降解菌菌株，发现该菌株在不同条件下可产生常见于白腐真菌的三类木素降解酶：LiP(木质素过氧物酶)、MnP(锰依赖过氧物酶)和Laccase(虫漆酶)，且具有较高的活性。本文研究了该菌株的产酶条件，比较了不同常用碳源和氮源及碳氮比对该菌株产酶种类及能力的影响，以及在摇床培养条件下不同培养时间该菌株的产酶量的变化。 1 材料与方法 1.1菌种：由本实验室筛选，能在以木质素为唯一碳源的无机氮培养基上生长的嗜碱性细菌6号菌株。 1.2 培养基：培养基基础溶液为(L-1)：1gK2HPO4，0.5gMg2SO4·7H2O， 0.25gMnSO4·H2O，0.1gCaCl2·2H2O，10gNa2CO3(单独灭菌)，pH≈10.5[3]。在此基础上，以加入硝酸铵(1.2g/L)为氮源并分别加入Klason木质素、蔗糖、乳糖、葡萄糖和可溶性淀粉各1g配成不同碳源限制培养基；以蔗糖(1g/L)为碳源，分别加入硝酸铵(1.2mg/L)、硫酸铵(0.912mg/L)、氯化铵(0.8025mg/L)、磷酸铵(1.8mg/L)、酒石酸铵(2.764mg/L)、乙酸铵(1.152mg/L)和草酸铵(2.13mg/L)配成不同氮源(1.5×10-2mol/L)的培养基；以蔗糖为碳源，硝酸铵为氮源，采用不同的碳氮用量配成不同碳氮比的培养基。 将菌株接种于各碱性液体培养基(每250ml锥形瓶装50ml培养液，每瓶接种0.5ml菌悬液)，每组实验做二个批次，每组每种条件各做三个重复。37℃、100rpm培养八天(该菌株处理麦草粉在八天后木素降解率达到30%以上，且此后降解率上升趋势平缓)后，取5ml，4000rpm离心5min，取上清液作为粗酶液测MnP、LiP和Laccase的活性。 1.3 Klason木质素的制备[4,5]：称取约1g麦草粉，用定性滤纸包好，放入索氏抽提器中，加入苯醇混合液(苯:乙醇＝2:1)，置沸水浴中抽提6小时(控制抽提液循环次数不得少于每小时4次)。抽提完后，将试样取出风干，转入已预冷致12～15℃含15ml72％的浓硫酸的250ml具塞锥形瓶中，塞紧瓶塞，摇荡1min，使试样全部浸渍在酸液中，然后恒温在18～20℃下保温2.5小时，并经常摇动锥形瓶。保温后转入1000ml锥形瓶中，加345ml蒸馏水稀释至酸浓度为3%，保持其浓度不变煮沸4小时，静置，过滤，将滤渣烘干到恒重即为Klason木素。 1.4 酶活测定： LiP[6]：该酶活性根据37℃下，黎芦醇(Veratryl alcohol)氧化成黎芦醛的速率来测定。总反应体积3ml含0.2mM黎芦醇、0.1mMH2O2、20mM琥珀酸钠缓冲液(pH3.0)，加入双氧水起始反应，310nm下测定三分钟吸光值的变化。酶活单位定义为１国际单位(1U)等于每分种氧化1μmol底物或生成1μmol产物的酶量。 MnP[7]：该酶活性根据37℃下NADH氧化成NAD的速率来测定。总反应体积3ml含0.3mMNADH，0.2mMMnSO4，柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)，加入酶液起始反应，340nm下测定三分钟吸光值的变化。酶活单位定义为１国际单位(1U)等于每分种氧化1μmol底物或生成1μmol产物的酶量。 Laccase[6,8]：该酶活性根据25℃下ABTS的氧化速率来测定。总反应体积3ml含0.5mMABTS，50mM甘氨酸缓冲液(pH2.5)，加入酶液起始反应，420nm下测定三分钟吸光值的变化。酶活单位定义为１国际单位(1U)等于每分种氧化1μmol底物或生成1μmol产物的酶量。 ２ 结果 2.1 碳源对产酶的影响 6号菌株培养八天后取出，测添加不同碳源的培养条件下，该菌株的LiP、MnP、Laccase的活性的有无和大小(表1和图1)。可见不同碳源对菌株所产生的木质素降解的种类和产酶能力的大小的影响是相差很大的，各种碳源条件下LiP的活性都很低，木质素有利于MnP的产生，酶活为283.50U/l，但没有发现LiP和Laccase活性；而蔗糖有利于Laccase的产生，且在此条件下MnP也具有较高的活性，分别为245.42U/L和122.53U/L，没有测到的LiP。在以葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉为碳源的培养条件下，也有较高的Laccase和MnP活性，同时有微量的LiP。由此可见，蔗糖和木质素的培养条件下的产酶能力有进一步研究的价值。
表1 不同碳源对嗜碱性木质素降解菌菌株产酶的影响
碳 源 | 葡萄糖 | 木质素 | 蔗糖 | 乳糖 | 可溶性淀粉
LiP(U/L) | 16.13 | 未检出 | 未检出 | 25.80 | 11.29
MnP(U/L) | 80.52 | 283.50 | 122.52 | 79.35 | 63.90
Laccase(U/L) | 166.17 | 未检出 | 245.42 | 188.73 | 181.45
*酶活单位以每升初始培养基体积所能产生的酶量计(下同)。
2.2 氮源对产酶的影响 以蔗糖(1g/L)为碳源，加入不同氮源各1.5×10-2mol/L，进一步研究不同氮源对该菌株产酶性况的影响，结果(表2和图2)表明，以硝酸铵为氮源时所产生的Laccase和MnP酶活性最高，而在其它氮源的培养条件下这两种酶的活性都不高，甚至没有活性。
表2 不同氮源的培养条件下的产酶能力
氮源 | 硝酸铵 | 硫酸铵 | 乙酸铵 | 酒酸铵 | 磷酸铵 | 氯化铵 | 草酸铵
Laccase(U/L) | 239.8 | 21.8 | 18.17 | 50.87 | 7.27 | 5.08 | 10.80
MnP(U/L) | 98.41 | 6.22 | 1.56 | 11.67 | 未检出 | 未检出 | 未检出
图1 不同碳源对嗜碱性木质素降解菌菌株产酶的影响 |  | 图2 不同氮源的培养条件下的产酶能力
2.3 限制氮源和不限制氮源两种条件下不同蔗糖用量对该菌株产酶的影响 碳氮比对菌株的产酶能力的影响也是一个极为重要的因素，以蔗糖为碳源、硝酸铵为氮源，分别研究限制氮源和不限制氮源两种条件下不同蔗糖用量对该菌株所产生的Laccase和MnP活性的影响。结果(表3和图3)表明，限制碳源的培养基有利于酶活的产生，而限氮培养基对酶的合成极为不利。
表3 嗜碱性木质素降解菌在碳氮比条件下的产酶能力
碳氮比* | 20/1.2 | 15/1.2 | 10/1.2 | 7/1.2 | 4/1.2 | 1/1.2 |  | 10/0.12 | 1/0.12
Laccase(U/L) | 116.48 | 135.42 | 145.04 | 188.98 | 216.40 | 236.75 |  | 3.28 | 24.28
MnP(U/L) | 44.81 | 61.89 | 70.81 | 75.38 | 101.95 | 105.58 |  | 0 | 2.61
*指在限制氮源和不限制氮源两种条件下的碳氮比，以每升碳源用量(g/L)：氮源用量(g/L)表示。

图3 不同蔗糖用量对该菌株产酶的影响(限制氮源和不限制氮源)

图4 嗜碱性木质素降解菌生长曲线

2.4 限碳培养条件下嗜碱性木质素降解菌的生长曲线、酶活曲线和pH的变化
采用限碳的培养基研究该嗜碱性木质素降解菌的生长曲线和产酶曲线以及pH在培养过程的变化，结果(表4和图4,图5,图6)表明，该菌株生长迅速，仅需３天便到达稳定期，而其产酶峰值为Laccase第4天，MnP第7～8天，可见该菌株所产生的木质素降解酶的分泌是在稳定期。

表4 限碳培养条件下嗜碱性木质素降解菌的生长曲线、酶活曲线和pH的变化
培养时间(天) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7
PH | 10.33 | 9.78 | 9.63 | 9.68 | 9.53 | 9.59 | 9.67
OD值 | 0.158 | 0.427 | 0.440 | 0.436 | 0.434 | 0.330 | 0.348
Laccase(U/L) | 0 | 24.28 | 129.94 | 628.03 | 255.15 | 282.88 | 261.07
MnP(U/L) | 0 | 25.19 | 43.84 | 65.14 | 98.58 | 117.02 | 128.45
培养时间(天) | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14
PH | 9.63 | 9.71 | 9.76 | 9.68 | 10.02 | 9.83 | 9.86
OD值 | 0.273 | 0.278 | 0.263 | 0.270 | 0.261 | 0.258 | 0.275
Laccase(U/L) | 256.25 | 257.41 | 255.23 | 213.00 | 229.75 | 189.58 | 208.35
MnP(U/L) | 129.76 | 115.44 | 113.89 | 110.10 | 99.84 | 95.26 | 90.13

图5 嗜碱性木质素降解菌的酶活曲线 图6 菌株在培养过程中pH值的变化

进一步研究同一培养件下经细胞破碎的细胞内木质素降解酶活性(图5)，胞内木质素降解酶的活性峰值(Laccase第3天，MnP第6～7天)稍早于胞外酶，这说明该菌株具有向外分泌木质素降解酶的能力，则有可能具有分解胞外大分子木质素的能力。
3 讨论
目前细菌降解木质素的研究所取得的进展不大，有关细菌所产生的木质素降解酶的种类和能力还存在着许多争议。我们研究本室实验室筛选的嗜碱性木质素降解细菌的产酶种类和能力发现，该菌株在不同条件下可产生目前在许多霉菌中发现的三大类木质素降解酶：LiP、MnP和Laccase，其中MnP和Laccase具有较高的活性。在研究过程中我们发现，采有不同的调控方法都不能使LiP的活性得到提高，且其酶活性一直很低或几乎没有；而MnP和Laccase的活性则可通过不同的方法改变培养条件得到极大的提高，尤其是以蔗糖为碳源的培养条件下，Laccase和MnP的酶量都得到了极大地提高，因此该嗜碱木素降解菌是极具研究价值的。
国内外有许多报道曾利用多种不同有机、无机或复合碳源和氮源来研究它们对微生物的木质素降解能力和产酶能力的影响，还研究了碳源或氮源限制对它们的影响。结果表明，碳源和氮源是微生物降解木质素和产酶的一个极为主要的影响因素[9]。该嗜碱性木质素降解菌仅在以木质素或蔗糖为碳源，以硝酸铵为氮源的条件下产生具有实际意义的木质素降解酶活性。在木质素培养条件下，能产生较高的MnP，但其产酶能力不太稳定，这可能与木质素的提取有一定的关系，且未能在以木质素为碳源的条件下提高该酶的产量。而在以蔗糖为碳源的条件下，该菌株产生两种降解酶：MnP和Laccase，两者的活性都较高，且在以蔗糖为碳源的条件下，可通过改变培养条件大大提高该菌株木素降解酶的产量，因而有必要进一步研究该菌株在此条件下的产酶调控机理。
限制碳源有利于该菌株木质素降解酶的产生，且酶活性在一定范围内随着碳源的减少而增加，而限制氮源则抑制了酶的产生，这一结果与此前有关报道是相一致的[7,10,11]。从菌株生长特性来看，该菌株生长迅速，从而有可能大大缩短降解木质素的时间，且其生长环境的pH值始终保持在9.0以上(这符合其专性嗜碱的特性)，由此在造纸工业的生物制浆和废水处理中具有极大有应用潜力。该菌株Laccase的产酶最佳时期在稳定期，且存在着一个明显的峰值，这可能是因为在摇床培养条件下该菌株生长迅速，稳定期仅2～3天，随后便很快进入衰老期；而MnP的最佳产酶时期则在衰老期，且趋势较为平缓。从酶活曲线可见胞外酶的酶活曲线滞后于胞内酶，可见该菌株能向细胞外大量分泌木素降解酶Laccase和MnP，这极有利于该菌株对胞外大分子木质素的降解。在限制碳源、37℃、100rpm的培养条件下，该菌株所产生木素降解酶Laccase和MnP的最高酶活性分别达628.03U/L(4天)和129.76U/L(8天)，其中Laccase的活性略高于目前所报道的白腐真菌的Laccase活性(不到600U/L)[8]，因而该菌株的产酶和对木质素的降解具有进一步研究的意义。
4 参考文献
[1] Purnendu Ghosh and Ajay Singh. Physicochemical and Biological Treatments for Enzymatic/ Microbial Conversion of Lignocellulosic Biomas. Advances in Applied Microbiology. 1993, 39:295-333.
[2] P Ghosh and A Singh. Advances in Applies Microbiology. 1993,39:316-26.
[3] Tetsuo Hamamoto and Koki Horikoshi. Alkaliphiles. Encyclopedia of Microbiology.Acasemic press,Inc. San Diego. 1992,1:81-87.
[4] 屈维均 陈佩蓉 何福望编 《制浆造纸实验》 中国轻工业出版社. 1992.
[5] Thomas J.Kerr, Robert D.Kerr and Ronald Benner. Isolation of a Bacterium Capable of Degrading Peanut Hull Lignin. Appl.Environ.Microbiol. 1983, 46(5):1201-1206.
[6] Brian P.Roy and Frederick Archibald, Effect of Kraft Pulp and Lignin on Tramestes versicolor Carbon Metabolism. Appl.Environ.Microbiol. 1993,59(6):1855-1863.
[7] A.A.Leontievsky, N.M.Myasoedova and L.A.Golovleva. Production of Ligninolytic Enzymes of the White Rot Fungus Panus Tigrinus. J.Biotechnol. 1994,32:299-307.
[8] Julio Tapia and Rafael Vicuna, Synthetic Lignin Mineralization by Ceriporiopsis subvermispora Is Inhibited by an Increase in the pH of the Cultures Resulting from Fungal Growth. Appl. Environ.Microbiol. 1995,61(7):2476-2481.
[9] Toky Noko. Degradation of Lignin by Alkalophic Bacteria,II,Degradation of Synthetic Lignin and Lignin Isolated from Steamed and Burst Wood. J.Biotechnology. 1993,31:93-98.
[10] M Ramachandra, D L Crawford and G Hertel. Appl.Environ.Microbiol. 1988,54:3057-3063.
[11] C Ruttimann-Johnson,C L Salas,R Vicuna and T K Kirk. Appl.Environ.Microbiol. 1993, 59: 1792-1797.

*国家自然科学基金资助课题(29677012) **通讯联系人 1999-02-15收稿,1999-05-10修回