Analysis of Free Amino Acids in Rat Brain Microdialysates by High-performance Liquid Chromatography Shu Hongjun, Han Huiwan, Liu Guoquan，Feng Fangbo (Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080) Abstract In this paper, Orthophthaladehyde (OPA) pre-column derivatization- reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)- fluorescence detection was employed to analyze the trace level of free amino acids (FAA) in microdialysates. The analytical method was systematically examined and the relative samples were determined with this method. It is possible to qualitatize and quantitatize 20 kinds of FAA in every 5µl microdialysate. AA neurotransmitters and their metabolites as well as other free amino acids in the microdialysates from the hippocampus and hypothalamic nucleus of the freely moving rat were measured with this method. The sensitivity and the linear relation between the amounts and the peak areas were satisfied. The recoveries were 83-109%. The detection limit reached 0.5- 5.7 pmol for each FAA. The column was Nova Pak C18 (Waters Co.) 5µm 150*3.9 mm (i.d.) operated at 40℃. The mobile phase consisted of two parts: buffer / methanol /tetrahydrofuran (THF) as solvent A (pH 7.2) and buffer / methanol as solvent B(pH 7.2), and within 35 min . The fluorescence detector was set at λex= 360 nm and λem= 455 nm. 5ul microdialysates, 5ul EA (ethanolamine) solution (internal standard, 2.5(10-6mol/L) were mixed and was derivatized by adding a mixture of OPA and sodium borate buffer solution. Finally the critical points for the conditions of HPLC and derivatization were briefly discussed. Key words Microdialysates, HPLC, Amino acids 摘要 简要介绍了一种测定大鼠脑内微透析液中游离氨基酸的高效液相色谱 (HPLC)分析法。用带梯度洗脱系统和荧光检测器的 HPLC仪，以邻苯二甲醛柱前衍生生化反应，RP－HPLC分离，在35min内将鼠脑微透析液中20种氨基酸进行了基线分离并有良好的线性关系和回收率。当信噪比为3时，各氨基酸的最小检出量在0.5-6.0 pmol之间。文中还对色谱分离和衍生条件的优化进行了扼要的讨论。 关键词 微透析 高效液相色谱 氨基酸 鼠脑微透析液中游离氨基酸的高效液相色谱分析 舒鸿钧 韩慧婉 刘国诠 （中国科学院化学研究所 北京 100080） 冯方波 （北京军区261医院 北京100094） 生化物质在动植物体内的分布及其在活体状态下的生理作用和代谢活动等是多年来一直倍受关注的问题，但由于实验技术方面的困难却未能很好的解决。微透析技术的出现对解决该问题提供了一个很有前途的方法[1]。 微透析（Microdialysis）是一种自生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。自1972年Dalgado[2] 发表第一篇有关微透析的文章后，微透析技术逐渐发展并日益成熟。与此同时，各种相应的检测方法亦随之建立起来[3,4]。但由于微透析样品体积小，难以进行前处理浓集，而各种生化物质的含量又很低，因而给样品测定带来了困难。 我们在多年研究的基础上建立了大鼠脑内微透析的实验方法（另文发表）。同时，为进一步将其用于神经科学研究的各个领域，亦对微透析样品中多种生化物质的分析方法进行了探讨。本文简要报告微透析液中游离氨基酸的分析。 1 实验部分 高效液相色谱仪为美国Waters公司的产品。以M680自动梯度控制仪控制2台510泵；M740数字积分仪；420荧光检测器。色谱柱为Waters公司Nova Pak C18柱，150×3.9mm(i.d.),粒径5μm。柱温40°C。 氨基酸标样购自Sigma公司。邻苯二甲醛和ß-巯基乙醇购自Fluka公司。甲醇为国产色谱纯试剂，乙酸钠、磷酸二氢钠、硼酸、四氢呋喃等均为国产分析纯。 氨基酸标准液均采用人工脑脊液配制成0.01mol/L的储备液,用时稀释成所需浓度。 衍生试剂的配制方法如下：准确称取5mg OPA溶于120μL甲醇中，加入10μLß-巯基乙醇和1mL 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH9.5)，混匀，存放于暗处。 准确移取5μL氨基酸标准溶液或微透析样品液，加入5μL2.5×10-6mol/L乙醇胺溶液为内标，再加入10μL衍生试剂，混匀后静置反应1分钟，加入10μL0.2mol/L KH2PO4(PH4.0)终止反应；立即取样25μL。 衍生化产物的HPLC分离采用二元线性梯度洗脱。A液为缓冲液/甲醇/四氢呋喃=400/95/5（v/v/v）；B液为缓冲液/甲醇=120/380（v/v）。缓冲液为20mmol/L乙酸钠溶液（pH7.2）。分离后的组分以荧光检测器检测。采用激发波长为360nm，在455nm处检测。 采用标准添加法以对标样中的氨基酸衍生物进行定性：（1）首先将浓度为1×10-6 mol/L 的氨基酸混和标样按上述方法衍生，并进行色谱分析；（2）将浓度为5×10-5 mol/L单一氨基酸标样同法衍生；（3）将上述衍生后的单一标样与混和标样按1：1混和，测得其色谱分离图：（4）比较两个色谱图，可知该选定氨基酸的谱峰在后面谱图中增高很多。据此可确定标样中各种氨基酸的洗脱顺序。微透析样品中各氨基酸的谱峰位置亦可采用类似方法确认。图1为以标准添加法确定GABA在谱峰中位置的示意图。图2为微透析液样品的色谱分离图，图中峰1-20分别为：Asp.、 Glu.、 Asn.、Ser.、Gln.、His.、Gly.、Thr.、Arg.、Ala.、GABA.、Tyr.、EA.、Met.、Trp.、Val.、Phe.、Ile.、Leu.、Lys.。
图1 GABA在色谱图中位置的确认 图2 微透析液样品的色谱分离图
2 结果与讨论 有关氨基酸OPA衍生化反应的报道不少[4,5]，但所用反应条件不尽相同。由于OPA试剂存在稳定性较差的缺点，故必须严格地控制各种反应条件，这是以柱前OPA衍生HPLC法进行氨基酸的定量分析成败的关键。 OPA试剂本身无荧光，因此可以大大过量以保证氨基酸衍生反应完全。但OPA到底过量多少效果最好，需要实验确定。为了保证定量的准确性，我们对此进行了研究。以六种递质氨基酸（即Asn、Asp、GABA、Gln、Glu、GLY）及其衍生物为代表，控制其它反应条件不变，仅改变OPA与AA的物质的量之比为200时达到最大响应，只有Gly在OPA/AA=400—500时达到最大。为了使每种氨基酸都衍生完全，本实验确定OPA/AA的比值为500。 由于OPA与氨基酸形成的衍生物稳定性较差，故恰当、准确地控制反应时间，不仅对方法的灵敏度，而且对定量的精确性都有很大影响。为此本研究考察了不同反应时间对各种氨基酸衍生物响应值的影响，结果表明，OPA与多数氨基酸的反应在60秒内已进行完全，个别氨基酸在90秒内反应完全。故将反应时间统一控制在90秒。 在早期发表的文献中流动相A采用乙酸钠或磷酸钠的缓冲液，一些氨基酸未能得到良好的分离，后来有人发现，在流动相中加入有机改进剂四氢呋喃（THF）有利于这些氨基酸的分离。本实验对比了使用THF前后的色谱图，验证了这一现象。在此基础上，对色谱分离的洗脱梯度进行了探索，最后确定为：0-2min，0%B；2-8min，0-15%B；8-18min，15-70%B；18-25min，70-100%B；25-30min，100%B；30-35min，100-0%B。 高效液相色谱分析常用的定量方法有归一法、外标法、内标法及内加法等。其中归一化法要求预先求出所有出峰组分的校正因子，这一点在此实验条件下很难做到；外标法受取样重复性及操作条件波动等因素影响易引入较大误差；而内加法对每种氨基酸进行定量时都需要在添加标准前、后分别测定一次，工作量增大不少。如能找到合适的内标物，以内标法定量校为简便。经过多次试验和筛选，我们发现乙醇胺能够较好地符合作为内标物的要求，因此选定其作为氨基酸定量的内标物。 将标准氨基酸储备液分别稀释成不同浓度（1×10-5，5×10-6，2×10-6，1×10-6，5×10-7mol/L）分别取5μL按上述实验方法重复测定，可以得到各氨基酸衍生物在不同浓度时的响应值。以响应值对氨基酸浓度作图，得到响应值随氨基酸浓度变化的曲线。结果表明，氨基酸的浓度在小于10-5mol/L时Glu和Gly的浓度与峰面积呈良好的线性关系。其它氨基酸的浓度-峰面积曲线在衍生量为0—500pmol范围内也具有良好的线性关系。当信噪比（S/N）为3时，各氨基酸的最小检出量在0.5—5.66pmol之间。 采用上述实验条件，对同一透析液样品进行5次重复测定，所得各氨基酸的保留时间和相对峰面积的相对标准偏差分别在0.79—1.93和2.89—9.68之间。 将经多次重复测定过的微透析液样品作为底物，分别加入3种不同浓度的氨基酸标准液（5×10-6，1×10-6，2×10-7），每个浓度重复测定5次，结果回收率在83—109%之间。说明方法的准确度可以满足微透析液中游离氨基酸的分析。 在大鼠脑内微透析实验方法的研究（另文发表）中，我们曾对微透析技术本身的重复性和氨基酸回收率进行了测定。在此基础上，可完成神经生物化学研究中的微透析取样及特定脑内游离氨基酸的分析。 3 参文考献 [1] Ugerstedt U. Curr Sep, 1986 7(2):43-46 [2] Delgado JMR. Arch Int de Pharmaco et de Therapic, 1972,198(1):9-21 [3] Acworth IN, Yu J et al. J Liq Chromatogr, 1994, 17(3): 685-705 [4] Umagat H, Kucera P. J Chromatogr, 1982, 239:463-474 [5] 叶惟泠，尹萍波. 色谱，1996，14（1）：14-17 1998-04-22 收稿，1998-09-24修回；国家自然科学基金资助项目