The Recent Development of Biomedical Materials for Tissue Engineering Shen Feng, Yao Kangde, Cheng Guoxiang, Cui Yuanlu, Feng Hanbao# (Research Institute of Polymeric Materials, Tianjin University, 300072 #Department of Engineering and Materials, National Natural Science Foundation of China, 100083) Abstract This article mainly introduces the recent progress of biomaterials for tissue engineering, especially on the influence from biomaterials to cell, extracellular matrix and tissue. The future development of this field is discussed. Key words Biomaterials, Tissue engineering, extracellular matrix 摘要 简要评述了生物材料在组织工程方面的研究进展。着重介绍了生物材料与细胞、细胞外基质和组织间的相互作用。对我国在该领域的发展前景进行了预测。 关键词 生物材料 组织工程 细胞外基质 组织工程相关生物材料研究进展 沈锋 姚康德** 成国祥 崔元璐 冯汉保# （天津大学高分子材料研究所 300072 #国家自然基金委员会工程与材料学部 100083） 众所周知，我们的身体由蛋白质、糖类和核酸等生物大分子为最小基本单元，形成细胞、组织和器官等高层次结构体，最后组成一个个整体。由细胞构筑生物人工器官形成了组织工程学[1]，即运用工程科学与生命科学的基本原理和方法，研究与开发生物学替代物来恢复、维持和改进组织功能。它将组织视同为一种复合材料，该复合材料由具有组织功能单元的细胞、细胞外基质(ECM)和支架构成。组织工程的基本思路是在体外分离、培养细胞，将一定量的细胞种植到具有一定形状的三维生物材料骨架内，并加以持续培养，最终形成具有一定结构的组织和器官。胶原型人工皮肤产品是组织工程成功的第一例，它以患者的表皮细胞或真皮细胞为细胞源，运用工程化方法制备皮肤同等品，将其贴敷于皮肤缺损部位。真皮细胞可由生体侧长入胶原片的微孔中，使皮肤再生，而胶原则在体内逐步降解并被吸收。 组织相关的细胞分离技术、大量细胞培养技术、基因组变换技术和生物活性物质释放等技术及其相关的生物材料问题是组织工程发展的关键问题，其中组织工程用生物材料是最富挑战性的领域，组织工程的成功亦有赖于生物相容性和特定细胞响应性的生物材料的开发。根据需要不同，在生物相容性优异的前提下、组织工程用聚合物材料可以是降解或非降解性材料(见图1)。
图1 研究中的组织工程
1 生物材料与细胞相互作用 生物材料为工程化组织形成的重要构成物。要选择适合组织工程的生物材料，必须要了解该材料对细胞生存力及其生长和功能的影响。目前常以细胞培养技术研究细胞与生物材料的相互作用。 粘着于固体基质的细胞的行为和功能取决与基质的特性。研究表明[2]，中等润湿性表面对细胞粘连最多。这可能和纤维蛋白在表面吸附相关。成纤细胞在聚合物表面的生长速率与其表面化学隐性相关，但细胞移动速率则取决于聚合物表面化学构成。由成纤细胞与聚合物基质接触角相关性研究确认，大多数疏水表面上单位细胞的细胞外基质合成速率较高。 常采用生物材料表面修饰改善，使其更适于细胞的附着与生长。例如用作组织培养的聚苯乙烯基材常用辉光放电或硫酸处理增加其表面荷电基团，以改善神经细胞的附着和生长。实际上，生物材料的表面化学形状会影响其在体内与细胞的相互作用。例如植入水凝胶与巨噬细胞融合，形成多核巨大细胞的能力随凝胶表面某些化学基团依次递减，即 (CH3)2N－＞－OH＝－CONH＞－SO3H＞－COOH(－COONa) 生物降解聚合物植入体内后会逐渐降解，然后为体内吸收。许多组织工程应用常以此类聚合物做细胞移植装置。Vacanti等[3]将5×106cm-1的牛软骨细胞接种到聚乳酸－聚乙醇酸共聚物骨架上，然后植入21只裸鼠皮下，在其中19只裸鼠的皮下获得了超过100mg的软骨组织。而Mori等[4]对比了不同生物降解基材上成纤细胞的体外培养情况，发现甲壳素及其衍生物的加入不利于成纤细胞的生长。这可能是由于甲壳素的碱性降解产物影响了细胞生存环境。 生物降解聚合物是控制细胞相互作用的又一因子：聚合物降解过程中，其表面不断更新，提供细胞附着和生长的动态基质。细胞在聚合物表面的附着、迁移和生长，可由从培养介质吸附或培养细胞分泌的蛋白质引导。细胞伸展与生物材料表面吸附纤连蛋白相关，因而有些研究将胶原类蛋白质固定于生物材料表面，使细胞培养基材更接近于组织内的细胞外基质(ECM)。这可藉胶原和其他ECM分子存在下单体原位聚合或随后在水凝胶中叠加而实现。 某些短氨基酸序列可与细胞表面的受体结合，且引导细胞粘连。例如，纤连蛋白含有三肽RGD(精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸)细胞结合微区。由于RGD对细胞粘连于细胞外基质(ECM)很重要。许多研究这已将此序列引入合成聚合物基质中。合成RGD肽已被固定化在聚四氟乙烯(PTFE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚氨酯(PEU)、聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸(PLA)等中。RGD的引入会使细胞粘连，细胞伸展，且形成病灶性接触。由于含细胞粘连受体的细胞仅识别某些细胞外基质分子，采用适宜的细胞结合序列还会构成细胞选择表面，因而可由肽结构调控粘连于聚合物的细胞群。 除了细胞－结合肽外，许多其它生物活性分子亦用于增强细胞在表面的粘连。对某些细胞，吸附碱性氨基酸均聚物可提高其粘连。此外，共聚键合氨基酸能影响细胞附着和生长。在聚合物上固定化糖，也会影响细胞附着和功能。 要指出的是生物材料表面形态会影响细胞行为。即植入材料的微观结构对植入区细胞行为有重要影响。如胶原的类型和其孔隙特性会显著影响所种植软骨细胞的表达类型[5]。 组织内细胞处于复杂的化学与物理环境。它完全不同于一般的细胞培养条件。许多研究者采用三维细胞培养方法模拟组织的化学与物理环境。PLGA、PLA和PGA纤维筛网、泡沫已用于构建细胞增殖功能的三维环境，用作组织工程结构骨架[6-8]。软骨细胞在三维PGA筛网中高密度培养时可生成葡胺聚糖与胶原，在组织学上类似于软骨的结构。此外，聚合物筛网的物理尺寸影响细胞生长效率，较薄的网生长较慢。 2 细胞外基质效应 细胞外基质(ECM)为复杂的蛋白质和糖胺聚糖交联网络。基质使细胞在空间组构，且为其提供环境信号。细胞和细胞外基质间相互作用是双向且动态的：细胞依据细胞外基质的指令从其环境中不断接受信息，而细胞亦可重构其细胞外基质。此类识别事件以细胞-面蛋白质和蛋白聚糖基质-固定蛋白质结合为基础。了解此类相互作用，就可在组织工程中模拟此类材料及细胞与其天然生物材料接口间相互作用。细胞外基质与信号不完全是固定的，有时细胞外基质为多肽生长抑制，特别是糖胺聚糖－结合生长因子如成纤细胞生长因子的贮存器。在某些情况下此类信号分子可由细胞外基质释出，成为释放和激活分子。一些细胞外基质间存在生物力学作用与反作用。对许多组织，特别是承载组织，生物力学对功能调节起着重要作用[6]。 细胞和细胞外基质间相互作用为细胞表面蛋白质和蛋白聚糖与固定在细胞外基质内的蛋白质相互作用。细胞表面有四类主要的粘连受体。第一类是参与同种细胞间粘着结合的表面受体钙粘着蛋白；第二类是可与糖聚合的选择性蛋白类，此类膜结合蛋白和血细胞与内皮细胞的异种细胞间粘着相关；第三类受体为免疫球蛋白类。不同于上述两类受体，此类蛋白质与其蛋白质配体结合和细胞外的Ca2+无关，且它们参与同种和异种细胞间相互作用。以上三类受体主要与细胞－细胞识别相关，而第四类整联蛋白质粘连受体则和细胞－细胞及细胞－细胞外基质结合有关。整联蛋白为二聚蛋白质，由α和β亚基以非共价方式组织成活性二聚体。 整联蛋白与细胞外基质许多蛋白质(包括胶原、纤连蛋白、玻联蛋白、von Willebrand因子和原粘连蛋白)结合。整联蛋白与细胞外基质中粘着蛋白结合有几种细胞形态特征。这包括细胞伸展，所谓粘着斑的细胞膜拉伸过程，粘着斑位点整联蛋白受体团簇化，和细胞外辅助蛋白组装以促进整联蛋白配合物附着于f-肌动蛋白细胞骨架。此类团簇受体位点和此跨膜受体与细胞外细胞骨架的相互作用承受细胞和细胞外基质或人工基材表面间的大部分应力。 上述细胞外基质蛋白质极其复杂，它们含有许多位点能决定结合胶原。结合糖胺聚糖与其他细胞外基质蛋白质交联，为蛋白酶降解、结合整联蛋白和其它粘连受体。此类蛋白质是多功能的，因而结合整联蛋白的位点有一小蛋白质微区，一般此受体结合微区尺寸相当于10个氨基酸残基长度的寡肽序列。目前三肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)为所确定的最小序列。将合成RGD的肽与表面或载体分子偶联，能重现蛋白质RGD位点的大部分粘连相互作用，许多此类高度特异亲和的受体结合序列已得到确认。 细胞外基质在与其接触的细胞影响下产生动态重组中，体外种植于单一组分的细胞外基质的细胞可粘着、伸展，形成粘合接触，去除原来的蛋白质，分泌不同蛋白质组分的新细胞外基质，而形成新粘合接触。在此细胞外基质的重组中细胞表面粘合和细胞衍生的自由酶起着主要作用。实际上膜结合和细胞释放的酶也参与细胞外基质的降解，使基质重组和细胞迁移。细胞释放的基质属原蛋白酶如胶原酶和明胶酶，丝氨酸蛋白酶如尿激酶、血纤蛋白溶酶原激活剂和血纤蛋白溶酶和组装蛋白酶分别与细胞迁移过程中的重组与降解有关。因而基材与细胞相互作用是双向的：细胞由基质接受信息；而基材为细胞设计。 总之，细胞与细胞外基质的相互作用，以不同方式控制粘着细胞的伸展与迁移、细胞基因表达、哺乳动物细胞分化、内皮细胞形态调节和由轴突神经突出等功能。 3 生物材料与组织工程 随着分子生物学和生物化学的进展，预先安排组装修复的生物材料成为可能。组织工程相关的生物材料除生物相容性外，还必需能诱发所希望的细胞响应。因而此类生物材料研究与开发的关键为控制细胞与生物材料的相互作用和设计与调控生物材料的组织响应，其产品的开发要根据细胞－细胞相互作用的独特环境，选择几种适宜的生物材料满足应用需求。其需求大致为：a)支持新组织生长，这里细胞-细胞通讯及细胞对营养物、生长因子和医药活性剂的利用度应最大；b) 能防止非期望的细胞活性；c)可引导组织响应(增强特定的细胞响应，而抑制其它反应)；d)增强细胞附着及随之的细胞激活(成纤细胞附着、增殖和真皮修复细胞外基质的产生)；e)抑制细胞附着和/或激活(如血小板粘着于血管移植物)；f)防止生物响应(如器官置换治疗中同种移植或异种移植细胞抗体的阻断)。根据硬和软组织工程的需要，可用生物陶瓷、化学修饰植入金属、生物降解聚合物进行组织工程研究，提供的许多解决组织损伤与器官衰竭的新途径。在生物材料领域，可以用细胞与生物工程方法调节细胞/组织行为，使组织－植入物界面产生临床所期望的生物效应，如齿科/矫形植入物。 3.1 生物陶瓷 羟基磷灰石、生物活性玻璃和磷酸钙陶瓷等具有生物活性、生物相容性，常用其涂着于矫形/齿科植入物，但有些生物陶瓷涂层的长期力学耐久性仍有争议。生物陶瓷还可用作骨缺损修复的人工骨基材填充材料。各种生物陶瓷置于骨组织可与其产生物理化学结合，有时能促进新骨形成，导致骨愈合。生物陶瓷的组成与结构决定在这类材料表面磷灰石的形成与其速率。 由于骨细胞在体内与生物陶瓷植入物表面相接触，通过成骨细胞在生物材料表面的培养可提供生物陶瓷如何从分子水平上引导细胞行为的信息[7]。生物陶瓷表面层的细胞/分子过程信息有助于设计可增强特异细胞功能而抑制所不需要的生物效应(如巨噬细胞过早激活)。 将有机聚合物(如赖氨酸)引入无机网络，出现了“有机磷灰石”新型生物陶瓷。可将有机磷灰石的有机组分用做载体释放药物或生物活性分子(如生长因子)至植入部位。聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸钠和复合聚丙烯酸钠和聚L-赖氨酸的有机磷灰石已在体内研究，结果表明，植入犬皮质骨35周后骨对合良好。 3.2 化学修饰植入金属 硅烷偶联剂能将许多如酶、蛋白质、抗体等生物活性分子固定于金属表面，此时原来为“惰性”基材转变成能从周围细胞/组织引起特异响应的基材。利用硅烷化学可将活性分子共价固定于生物材料上。例如共价固定于硅烷化Co-Cr-Mo合金再以离液剂处理的胰蛋白酶的残留活性高于简单吸附和由离液剂处理该合金的胰蛋白残留活性。 鉴于约成骨细胞粘连为细胞膜整联蛋白与细胞外基质粘连蛋白的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS)序列引导。培养试验确认以此粘连RGDS修饰基材在成骨生长蛋白OP-1存在下会促进成骨细胞矿化。这归结于生物活性分子与原活性生物材料表面可协同提供临床所需的细胞功能。 3.3 生物降解聚合物 组织工程得益与许多生物可降解聚合物的开发及其临床应用，而组织工程的发展则促进了现有医用级聚合物高性能化和新合成聚合物的开发。 生物降解聚合物用于组织修复或重建为目标的组织工程产物(如人工皮肤，软骨和末梢神经修复)，而不是要求材料长时稳定的场合(如人工心脏、肾和肝)。生物降解聚合物必需易于制造和加工；其力学性能适于短期功能的发挥，且不干扰长期功能；它的降解产物对局部组织反应和系统反应低或无毒；对活性化合物的释放或附着相容。生物降解聚合物包括生物衍生的生物吸收聚合物和合成聚合物。 4 未来的研究 组织工程的成功有赖于许多领域的研究进展，要从细胞生物学阐明控制细胞分化和生长，及细胞外基质如何影响细胞功能的机制。免疫学与分子遗传学提供不为免疫体系排斥的细胞或细胞移植体系的设计依据。 细胞源与细胞保存是重要问题，所移植细胞可来自细胞株或原发组织如患者，其他供者动物源或胎儿组织。选择细胞源时应综合平衡伦理问题、安全问题和功效。某些细胞可成功地用冷冻保存，但仍需建立适用于许多不同细胞的广谱性细胞库。大规模细胞培养系统的建立才能确保所需细胞体外增殖和营养物传递问题。 天然生物材料的优点是其所含的信息(如特定氨基酸序列)利于细胞附着，或保持分化功能。而其缺点是许多天然材料每批不同或批量大小有差异。合成聚合物则能精确控制分子量，降解时间、疏水性等，但它们与细胞/组织的相互作用不够理想。利用天然聚合物的重要序列接枝到合成聚合物，将天然与合成聚合物优点集成是较好的解决方法。 聚合物加工问题也很重要。许多植入物由复合材料或高度孔隙结构材料，此类植入物制备的重复性对其成功甚为重要。持续控制释放体系的开发对调控许多组织诱导因子、生长因子和血管生成刺激因子很有意义。而细胞与此类生物材料界面的研究方法的开发和数学建模，将有助于预测体内细胞行为[8]。 目前，器官移植和再建为高价的治疗方法。组织工程所提供的组织取代物可望比器官移植便宜得多。1994年世界上组织工程(包括生物人工器官和细胞治疗)的总效益为1300万美元，预计到2000年将增至27亿美元，市场前景广阔。这里生物材料的研究与开发正面临新的挑战与机遇。希望我国的工程科学与生命科学领域的研究者们能更深入地涉足人口与健康的这一高技术领域，发挥学科交叉与融合的整体优势，使我国在该领域占有一席之地。 5 参考文献 [1] Langer R and Vacant J P, Tissue engineering, Science, 1994,260:920-925 [2] Saltzman W M, Cell interaction with polymers in principles of tissue engineering. eds by Lamza R, Langer R and Chick W, Austin: Landes R G Company, 1997:225-226 [3] Vacanti C A, Langer R. 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