Progress of Modern Liquid Chromatography Han Nanyin, Wang Lisheng, Fu Ruonong (School of Chemical Engineering and Materials Science, P.O.Box 602,Beijing Institute of Technology,Beijing 10081) Abstract The paper dealed with the progress of developing history, stationary phases, fluid phases and detectors of liquid chromatography. It has important reference values for chemists to learn the new progress of modern liquid chromatography in the field of chemistry. Key words Modern liquid chromatography, Stationary phase, Fluid phase, Detector 摘要 本文在查阅大量文献的基础上从液相色谱的发展史、固定相、流动相以及检测器四个方面综述了液相色谱的进展，对了解液相色谱的新进展有着重要参考价值。 关键词 液相色谱 固定相 流动相 检测器 现代液相色谱进展 韩南银 王利生 傅若农 (北京理工大学化工与材料学院602信箱 100081) 色谱法最初仅仅是作为一种分离手段，是根据混合物中不同组分在流动相和固定相间具有不同的分配系数,当两相作相对运动时，这些组分在两相间进行反复多次的分配，从而得到分离。直到五十年代，人们才开始把这种分离手段与检测系统连接起来，成为一种独特的分析方法，是几十年来分析化学中最富活力的领域之一，也是生命科学和制备化学中广泛应用的一种手段。 色谱的发明者，俄国植物学家M.S.Tswett，是在研究植物色素的过程中，于1906年创立这种简易的分离技术，奠定了传统色谱法基础。从此之后，化学家、生物化学家和生理学家们在制备高纯化合物、分离和鉴定复杂混合物时便有了一条崭新的有效途径。自从有了这种手段，使许多过去被认为是单一的物质，判明却是多种化合物的混合物；许多化学反应的过程依靠这种方法而得以探讨；终于使许多复杂混合物，例如维生素、药物、色素、氨基酸等得到离析；这种方法甚至帮助科学家们了解了一些长期模糊不清的自然现象，诸如植物与动物的营养、激素对人和动物的生理特性、维生素在动植物体中的分布等等问题。Tswett 的实验意义很大，尽管他于1907年在德国柏林植物学会议上反复强调色谱技术，但并没有受到当时科学界的重视。经过二十五年后，德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。另外他还发现了八种新的类胡萝卜素，并把它们制成纯品，进行了结构分析。同年，他又把注意力集中在维生素的研究上。在确定了维生素A 的结构以后，于1933年从35000升脱脂牛奶中分离出一克核黄素（即维生素B2），制得结晶，并测定了它的结构。此外，他还用色谱法从蛋黄中分离出了叶黄素；还曾把腌鱼腐败细菌中所含的红色类胡萝卜素确定离析出来并制成结晶。Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖，也正因为他的出色工作使色谱法名声大振，迅速为各国科学家们所注目，广泛被采用起来。 1 液相色谱固定相 1.1 正相色谱 八十年代初，人们使用的正相色谱固定相硅胶和吡啶硫氰酸镍盐的络合物晶体能与芳香族化合物形成包合物用于分离芳香族含氮异构体和胆甾醇晶体。已有人[1]将焦炭吸附剂作为填料和键合硅胶作过比较并研究其热力学机理。具有离子化或非离子化功能团的大孔聚合物也开始应用于液相色谱，这些聚合物在整个酸碱范围内稳定，其中一个缺点是当溶剂改变时，它们会热胀冷缩，但是其主要的分析方面用途，即从水中收集痕量研究化合物是没有问题的，通过适当的处理装入色谱柱，一些物质出现过度的峰带变宽 ，而另一些则出现尖、窄的峰带和高分离度，在强碱性大孔树脂中120分钟内可分离100 种尿液中紫外吸收物质[2]。有人将各种链长度的碳氢配位体键合到硅胶上，根据链长短效应研究保留值的影响，也有过类似的报道，将C22 键合相以及制备键合相担体各种条件作过比较，其键长度和吸附自由能成线性关系。一般地，碱溶液会破坏硅胶，烷基胺比季铵盐更会腐蚀硅胶填料，故通过加填有5m m 硅胶的短预柱来洗脱碱性溶液。Kataev等[3]用聚三氟苯乙烯涂成的硅胶微粒基质并应用到卤代芳烃、多肽和蛋白质的分离。1993年11月，Majors 讨论了在日本发展迅速的HPLC 聚合物填料。Hosoya 制备了大孔聚合乙烯—对—叔丁基苯甲酸丁酯微球和两种别的聚合物微球的性能以及更多的C18HPLC固定相。 1.2 反相色谱 固定相的研究进入九十年代更是热火朝天。这方面的研究报道远远超过流动相的研究，人们不断探索保留过程及相关烷基键结构的复杂性和可能制得的各种新型固定相。Bolok 和其合作者从统计技术研究反相色谱柱的老化过程。Montes 等评价了一种硅氢化物介质的硅氢烯制备烷基键合相，更早时候基质制备可供参考。Moriyama等评价了用2mm硅胶制得的TSK胶Super ODS新型反相色谱柱的特性，他们论述了如何分离手性化合物。 Schmid与合作者论述了含饱和脂肪酸键合相的合成与性质，并且与相应的饱和烃固定相的使用作过比较。Pesek和Matyska合成了两种不同的二醇键合相，包括一种是“可靠的”，另一种通过将7－辛烯－1，2－二醇直接连接到氢化硅基质上。Jino和Nakamura [4] 评价了用氟处理的键合硅胶作为一种反相色谱基质与常规反相色谱基质的选择性不同。Buszewki 等比较了烷基胺和烷基键合相基质用于反相分离，发现前者对分离极性化合物效果显著，但其热稳定性不如后者。Wongyai 用苯丙醇胺键合到硅胶上产生离子交换——反相基质的混合模型，并且评价了酸性系列、中性和碱性物质的分离效果。Friebe 将Calixarene键合到硅胶上研究其作为选择相能够形成类似于环糊精的内包合物。Chriswanto 和伙伴们将聚吡咯相涂在硅胶上作为HPLC 的特征化填料。Ge等合成了聚3－辛环吡咯改性硅胶，评价其作为蛋白质的分离及探讨酸、碱介质的稳定性。Skapo和Simpson则在流动床中制得反相基质，他们总结出在有机溶剂中通过这种途径与常规键合相比较可制得重现性更好的基质。Theinpont 论述了在HPLC 柱中已经填装好的硅胶的衍生化过程和通过这种途径制得的色谱柱和常规键合相色谱柱进行了比较。 1.3 亲和色谱 日本和欧洲较多研究多孔聚合物在液相色谱中的应用，这些聚合物可用于分离各种芳香族化合物和糖类，高分子填料对保留值有较大影响，依据不同溶剂洗脱次序，可估算出聚合物溶解度参数。它们适用于亲水溶质排阻色谱，如有一种吸附剂TSK-SW 硅胶带有亲水键合相，在较大的流速下能经受高压且有非常高的分离度，尤其适用于蛋白质和腐殖酸的分离。曾有人描述过带羟基、氰基、铵离子及芳基金属醚键合到硅胶上，铵离子键合相主要以氢键结合，通过溶剂作用稳定保留值。 1.4 离子交换色谱 离子交换固定相的确研究过不少，如八十年代初流行的TSK型SW硅胶及基于二乙胺乙基(DEAE) 制成的阴离子交换材料用于蛋白质及核酸的优化分离，低聚糖的分离采用Micro-Pak AX-5。XAD 树脂是色谱中使用最基本的固定相，弱酸、弱碱及两性电解质的分离均有人研究过，反离子以扩散双电层形式存在。也有人制备多孔甲基丙烯酸盐离子交换剂，但多数人愿意使用商品化的交换剂。Sevec 和Frechet [5] 制得聚甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚二甲基乙烯丙烯酸酯色谱柱 (300×8 mm) 用于蛋白质离子交换的制备色谱。他们能做到一次进样到这种色谱柱分离300mg 的蛋白质混合物。Gawdzrk 和 Matynia制备了一种交联的(p,p’—二羟基苯)—丙烷二环氧甘油醚和二乙烯苯的甲基丙烯酸酯的多孔共聚物作为一种最新的HPLC填料并且评价了其作为正相和反相分离的效果。 Danielson 和其合作者[6] 用一种丙胺基硅基质同Kel-F800 反应制得一种弱阴离子交换填料。 1.5 空间排阻色谱 Kato 等曾通过丁醚或三乙醇苯醚与TSK G3000 SW 空间排阻色谱法 (SEC) 结合合成 HIC 固定相材料，当使用盐溶液梯度洗脱时，可达到很高的分离度。一些极性键合相通过分配比调节的排阻色谱分离蛋白质和多肽。Miller 等报道过用醚相结构合成大孔硅胶填料：Si-(CH2)3-O-(CH2CH2O)n-R;n=1,2或3;R=Me,Et或n-Bu。用这种填料制得的色谱柱可至少连续使用五个月其保留值不变。 烷基链长度和配体密度能直接影响到保留值与分离度，而使用低配位数密度基质更易再生，不易变性，对分离大多数蛋白质来说，基质微球直径在300Å 时具有最强的再生力，直径小到1mm的多孔微粒填入1cm 的色谱柱中对于蛋白质的分离十分有用。另一改进色谱有效途径是使用非多孔微球(1-3mm)， 柱长约30mm，柱效稳定，当小心控制流动相温度和所有仪器组成时，柱外效应很小，曾有人通过洗脱法在2分钟内分离6种蛋白质的混合物。 Smigol[7] 论述了均相聚合甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚乙烯二甲基丙烯酸酯微球用特殊化功能的多孔介质制得二醇或二乙胺相有较大孔隙和十八烷基官能团有较少孔隙，这样制得的一种基质当所有分子接近极性相时，较少的分子进入多孔介质，而限制了大分子进入到十八烷基键合相中。 总之，不论是何种类型的固定相对于手性异构体的拆分以及蛋白质和多肽大分子的分离仍在不断的探索完善之中，从发展的趋势看，寻求各种高分子材料作为新型色谱固定相前景光明。 2 液相色谱流动相 液相色谱应用广泛的是反相色谱，其流动相的优化组合直接关系到分离效果。八十年代二元流动相组成优化依赖于容量因子(k’)的对数值与极性溶剂的摩尔分数关系，根据两者线性关系，可以估算溶质的保留值。曾有人确定过14种二元溶剂系统的容量因子与流动相的关系。Scott,Snyder和Soczeuinski的色谱模型被应用于分离烷基酚和萘酚，使用m Bondapak NH2 固定相，Nurok和 Richard建立了一个简单的方程来确定溶剂组成的优化，这种方法既可以用于TLC也可以用于HPLC。六种等离子强度溶剂的结合被应用于产生六种三元流动相，用于分离大范围的化合物，这些混合物的极性通过增加极性溶剂来调节。Zima和Smolkova报道过在碳吸附剂上氨基酸保留值的酸碱效应及离子强度，并且给出一系列方程式预言这些两性电解质的保留行为。Markl曾将有机磷和硫加入到流动相中可以调整硅胶表面，这些化合物吸附在硅胶表面由于氢键作用而改变了选择性和溶质的保留值。 Hitachi化学公司用于二甲基乙烯酰胺和二甲基聚丙烯酰胺流动相用无机酸调节PH 2 -6来分析PI2550使用二乙烯苯—苯乙烯作填料，曾获得专利。Cole和Dorsey研究过在反相分离梯度洗脱过程中二次平衡保留时间问题，他们发现当加入3％1-丙醇到强溶剂和弱溶剂中去时，二次平衡时间大大缩短。在反相分离过程中，曾有人作过三种研究关于分配过程中热力学驱动力。Sentell和Henderson研究过C18 相作为温度和键合密度形状选择性并且发现低于室温和高键合密度固定相可获得较好的选择性，他们建立了范德荷夫座标图并且指出作为一种功能键合密度图形的差异。 Gheong和Carr曾使用对于烷基苯在水和4种最普通的有机混合溶剂的一系列无限稀溶液的活度系数的混合物中，观测其保留过程。他们注意到非极性溶质在饱和的十六烷甲醇溶液中和在纯十六烷溶液中测得的活度系数稍微不同，表面积对键合的体积比率在键合相色谱中至关重要。 Park等曾利用Kamlet-Tafl溶剂化色谱图途径来研究保留过程，他们测得氢键给体对甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和四氢呋喃的水溶液的混合物的酸度进而研究单取代酚基于溶剂能量线性关系的保留值。聚合芳香烃的使用作为一种探测保留过程，尤其是对于相关的选择性引起人们浓厚兴趣。这些研究很成功，国际标准和技术协会已公布过这种标准参考材料作为评价反相柱的选择性，其中有两种观点，Sander和Wise[8] 发表过杰出的论文论述选择性及其评价这种性质途径。Hoffman和Chang报道过一些溶质溶解在弱极性溶剂中再注射到强极性流动相时峰高和塔板数的增加，vukamanic 等注意到进样溶剂的选择能影响峰的完整性，包括产生裂峰和激变峰。已有各种各样的途径研究保留值和选择性。有人曾连续使用同系物摸索选择性，其它选择性特征化的方法包括主要成分的分析和利用置换机理对于溶剂的模型吸附到键合相中热力学处理。Kowalska 也利用甲醇—水流动相调整溶质保留值，Kaibara等人则研究过反相固定相同溶质的反应，也有人[9]尝试过利用UNIFAC 法评价保留值，p－p 键反应的作用，用不同的三元溶剂系统计算等强度的流动相，用溶质和流动相分配系数描述溶质保留值，用体积特性参数如粘度、介电常数等关系反相保留值，还有用信息理论和“负熵”描述保留行为。Skelly等开发计算机辅助选择内标物，可从90种内标物的数据库中依据保留时间的排列次序择其所用。 溶剂化显色现象尤其利用Kamlet-Talf 公式近年来成为探索色谱保留值时髦的工具。这可从最近连续的报道中可以看出。不管研究流动相还是固定相其氢键效应仍然非常重要。Carr研究小组[10]仔细地测量了甲醇、乙腈、2—丙醇和四氢呋喃(THF)水溶液混合物的氢键给体酸度并讨论了相关的反相色谱保留值。Cheong和Choi[11]认为可以利用线性溶剂化能量关系预言保留值，为了获得合理的关联系数在保留值和溶质极性参数之间应排除强氢键力的溶质，他们假定可以利用在固定相上残余氢氧根离子同这些化合物特殊的相互关系做到这点。Carr小组[12] 另外也论述非常有价值的有关ET(30) 溶剂强度的限度，他们指出如果在整个溶剂范围内即从100％水到100％有机改良剂存在非线性化性，同时也应该再次强调，这也适合于别的单一参数溶剂，包括体积百分数对k’作图和溶剂强度参数S。三元流动相组成溶剂的选择性及特性也是人们感兴趣的研究内容。Levin 等[13] 提出一种在二元流动相相关实验基础上预言三元流动相的保留行为。Dzido 和Eegel-hardt 研究了单取代极性官能团芳香族烃类化合物选择性的变化，并且解释了分子形状大小、溶质和改良剂间的相互关系以及溶剂化络合物在固定相中先后次序的变化。Heron 和Tchapla[14] 研究了非水介质反相LC的溶剂选择，发现Kaelble 三角图比众所周知的Snyder三角图更为有效。 各种各样的研究有助于我们更好地理解流动相在保留过程中的作用。Chen和Pietrzyk表面选择性、有效性、线性烷基苯磺酸的分离度能通过流动相离子强度和电解质阳离子的选择得到提高。Busewski 等[15]研究了流动相组成关于烷基胺相的保留值和选择性的影响，Seibert 和 Poole应用一种溶剂化参数模型使丙腈硅烷固定相同甲醇、乙腈、2—丙醇和四氢呋喃流动相的保留性质特征化。流动相添加剂的研究也引起人们关注。McCrossen和Smpson研究戊腈和己腈作为流动相添加剂，发现加入少数的这类物质可引起保留值的明显变化还能明显改善有机胺的峰型。McCalley[16] 研究有机溶剂强度对一些基本化合物的峰型影响，发现THF和甲醇比乙腈作流动相有更好的色谱峰，尽管不同溶质的行为有相当大的变化。 Olesik 研究小组的兴趣也继续集中在流动相的“增强流动性”上。当少量的二氧化碳加到传统的反相色谱流动相时，其粘度减少，扩散系数增大，柱效提高。Lee和Olesik研究了结合升高温度可进一步增大扩散系数和柱效，Cui和Olesik[17] 报道过应用基础化学对这些方法的改进，指出除了降低粘度外，二氧化碳也能破坏甲醇—水混合物的氢键。 3 液相色谱的检测器 液相色谱中检测器是最脆弱的部分。八十年代初便有各种各样的检测器问世，但一般集中在高等院校和仪器公司里。有关检测器应用的论文成千上万。最流行的是可变波长检测器，而固定波长检测器由于最适合用于大范围的各种芳香化合物得到广泛应用。折光指数检测器，主要是应用空间排阻色谱在高分子工业以及食品和饮料工业中糖的检测，由于工业界很少发表所测得的结果，其论文数相对较少。发展最迅速的是开变波长光电检测器和电化学检测器。依赖使用的检测器合理检测峰型或试样纯度，用柱前和柱后衍生化技术和别的新技术(如化学放大或激光源使用)获得更多的信息。 除了早期LC书籍中所涉及的检测器外，还有许多现在HPLC检测器方面的综述[18]。随着后来发展，毛细管液相色谱和毛细管电泳中使用敏感的吸收系数检测器，其一途径是论述了光照射晶轴得到明显的改进，另一途径论述了从吸附电解质到荧光物质增加到流动相中能量转换，用连续的次级发射改进检测限。Berthod 论述了LC中激光检测器的使用，他讨论LC检测器性能需要，相关激光性能，以及几个激光—LC相结合的例子，包括光扫描、荧光、光电离子化、热光离子化、折光率、光度和声光检测器。Dasgupta[19] 引用170篇参考文献论述柱后操作技术在离子色谱(IC)中改进选择性和敏感度，Rochlin[20] 引用36篇文献比较不同类型的检测器。 液相色谱新的检测技术不断发展，以适应毛细管和微球柱大小的需要，Fielden论述了近几年正在迅速发展的液相色谱检测技术，并将其分成二大领域，即光谱和电化学检测器，他也考虑到扩大柱后流动试剂检测领域。据此，Freeman 等论述了在液相色谱中生物化学柱后反应检测技术，酶、蛋白质和抗体的使用从改进检测器选择性和敏感度角度讨论。Martin等人论述了当今控制环境污染分析和监测方面面临的挑战，他们检验了多种分析技术，包括一些液相色谱仪，可以保证应用于控制环境污染问题，在相关的一篇综述中，Chau评价了可以提供分析金属离子的色谱技术，液相色谱技术同特殊元素检测相结合，可以分离金属络合物结构，对于大气、水、残渣和鱼样的金属离子分析具有重要意义。 在近年来兴起的DNA分析领域中，已有不少人报道评价聚合酶链反应产品的液相色谱分离和检测中定量分析准确度和精密度。Gaus描述了由PCR 允许的DNA放大技术准确定量，不需要放射性标记。在一项值得庆贺的研究中，Schmitt等论述了如何合同放大二极基因组的样品作为内标物，在PCR基础上，在各种细胞和组织中主要基因组样品和成纤维细胞增长因子b 的液相色谱分析。 各种各样检测器的研究论文层出不穷，如紫外—可见光度检测器， 拉曼光谱检测器，荧光检测器，化学荧光检测器，质谱检测器，电化学检测器，核磁共振检测器以及光电二极管阵列检测器等等。总之，检测器的研究其共同的方向均朝着灵敏度高、重新性好、相应快、线性范围宽、适应范围广、对流动相流量和温度波动不敏感、死体积小等特性。 4 参考文献 [1] Taylor P J, and Sherman P L. J. Liquid Chromatogr. 1979,2:1271. [2] Seta K, Washitake M, Anmo T, Takai N and Okuyama T, Bunseki Kagaku .1978,27(73). [3] Kataev A D, Saburov V V, Reznikova O, Kapustin D V, Zubov V P. J.Chromatogr. A 1994,660:131-6. [4] Jinno K, Nakamura H. Chromatographia. 1994,39:285-93. [5] Svec F, Frechet J M, J. Chromatogr. A 1995,702:89-95. [6] Danielson N D, Wangsa J, Shamsi S A. J. Liq. Chromatogr.1995,18:2579-92. [7] Smigol, V, Svec F, Frechet J M. J. Anal. Chem. 1994,66:4308-15. [8] Sander L C, Wise, S. A.LC-GC .1990,8(5):378. [9] Dasko L. J. Chromatogr. 1991,543(2):267-75. [10] Jpark J H, Dallas A J, Chau P, Carr P W. J. Phys. Org. Chem.1994,7(12):757-69. [11] Cheong W J, Choi J D, Bull. Korean Chem. Soc. 1994,15(10):868-73. [12] Park, J H, Dallas A J, Chau P, Carr, P W. J. Chromatogr. A1994,677(1):1-9. [13] Levin M, Grizodoub A, Leontiev D, Georgievsky V. Chromatographia.1995, 40(516):321-8. [14] Heron S, Tchapla A. Analysis .1993,21(6): 269-76. [15] Buszewski B, Jaroniec M, Gilpin, R K. J. Chromatogr. A 1994,668(2):293-9. [16] McCalley D V. J. Chromatogr. A 1995,708(2):185-94. [17] Cui Y, Olesik S V. J. Chromatogr. A 1995, 691(1-2):151-62. [18] Mckinley W A, Popovich D J, Layne T. Am. Lab. (Fairfield, CT)1980,12(8):37-38,40,42,45-47. [19] Dasgupta P K. J. Chromatogr. Sci. 1989,27:422-48. [20] Rocklin R D. J. Chromatogr. 1991,546:175-87. 1998-05-30 收稿