Effect of Ce3+ on cAMP Signal System Shen Zhiguo, Lei Hengyi, Wei Qing#, Yang Xinfen#,Zhuang Zhixiong##, Yang Yansheng (School of chemistry and chemical engineering,Zhongshan University, Guangzhou 510275, China #School of public health of Sun Yat-sen Medical University,Guangzhou 510089,China ##Preventive and anti-disease station of Shenzhen, Shenzhen, 518020 China) Abstracts In this paper, the effect of cerium(Ⅲ) on adenylate cyclase in rat liver was studied. The results showed that cerium(Ⅲ) could inhibit the AC activity of rat liver plasma membrane in low dose and recover it in high dose. Cerium(Ⅲ) also could enhance the concentration of cAMP in primary hepatocyte by adding theophylline in medium. These results suggested that the cerium(Ⅲ) might affect the cAMP signal system. The influence of cerium(Ⅲ) on cAMP signal system might be one of the mechanisms by which rare earth elements affect living things. Key words Rare earth element, Cerium, Rat, Liver, cAMP, Adenylate cyclase 摘要 研究了Ce3+对大白鼠肝脏质膜腺苷酸环化酶的影响及Ce3+对培养原代肝细胞内cAMP含量的影响。结果表明，低浓度的Ce3+抑制质膜腺苷酸环化酶的活性，高浓度的Ce3+能使质膜腺苷酸环化酶的活性恢复；在培养基中加入Ce3+能使肝细胞内cAMP含量增加，茶碱能强化Ce3+的作用，表明Ce3+能激活腺苷酸环化酶。结果提示Ce3+对环腺苷酸信号系统的影响可能是稀土元素对生物的作用机制之一。 关键词 稀土元素 铈离子(Ce3+) 大白鼠 肝 环腺苷酸 腺苷酸环化酶 Ce3+对环腺苷酸信号系统的影响* 申治国 雷衡毅 魏青# 杨杏芬# 庄志雄## 杨燕生 （中山大学化学与化学工程学院 广州 510275 #中山医科大学公共卫生学院 ##深圳市卫生防疫站） 稀土元素的广泛应用已引起人们越来越多的关注，稀土元素的生物效应机理研究已成为一个热门课题。随着稀土的应用，目前被认为是人体非必需的稀土元素将通过食物链在人体内积累，但稀土元素的生物效应机理及其对人体的影响尚不清楚[1]。许多证据表明稀土离子不能进入正常细胞内，稀土对细胞的大部分生理效应是基于稀土离子与细胞膜外表面的相互作用[2]。 环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）作为第二信使广泛存在于动物体各组织中。质膜腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)是细胞膜上唯一能催化ATP生成cAMP的酶。cAMP由AC催化ATP产生，并通过环腺苷酸磷酸二酯酶(cAMP phosphodiesterase, cAMP-PDE)催化水解灭活cAMP来调节细胞内cAMP水平。细胞内cAMP的含量变化主要取决于AC对ATP的催化活性和cAMP-PDE对cAMP的水解速度。在肝细胞中，cAMP促进糖原分解，抑制糖原合成，并在糖原代谢中对蛋白磷酸化和脱磷酸化进行调控。此外，cAMP还是一个重要的基因表达调控物质[3,4]。 肝脏是稀土元素最重要的靶器官，在各器官中，以肝、脾中的稀土元素含量为最高。AC对ATP的催化和cAMP-PDE对cAMP的水解都需要Mg2+的存在。茶碱是cAMP-PDE的抑制剂，若用茶碱抑制cAMP-PDE的活性，就可抑制cAMP-PDE对cAMP的水解，那么cAMP含量的变化就取决于AC的活性。本文研究了Ce3+对离体大白鼠肝质膜AC活性的影响和长期喂饲含Ce3+饲料的大白鼠肝质膜AC活性的变化，同时还研究了Ce3+对培养的原代肝细胞内cAMP含量的影响，探讨了Ce3+的生物效应机理。 1 材料与方法 1.1 实验材料 SD大白鼠(购自广东省实验动物场) 1.2 主要仪器 CO2细胞培养箱、倒置显微镜、超净工作台、恒温水浴箱、无菌室、125I放射计数仪、玻璃匀浆器 1.3 主要试剂 CeCl3和Ce(NO3)3(由分析纯CeO2制备)、ATP二钠盐(Serva)、二硫苏糖醇(DTT，Fisher Biotech)、胶原酶(Sigma)、DMEM培养液(Gibco)、胰岛素(Sigma)、茶碱(上海试剂二厂)、125I标记的cAMP试剂盒(上海中医药大学同位素室)、蛋白质含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、蛋白质标准液（南京军区总医院） 1.4 实验方法 1．4．1 整体动物肝质膜AC活性的测定 大白鼠用加有不同浓度Ce(NO3)3的饲料喂养，饲料中Ce含量以CeO2计分别约为0、20、40、80、160、320 mg/kg，每组6只雌雄各半。自然光照条件下喂养一年。大白鼠断头处死，按文献[5,6]取大约1 g肝脏，按1：20(w/v)加入预冷的Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)，用玻璃匀浆器冰浴下高速匀浆。取100m L肝匀浆液测定质膜AC的活性。反应介质中含50 mmol/L Tris-HCl缓冲液、4 mmol/L DTT、5 mmol/L茶碱、4 mmol/L MgSO4、1 mmol/L ATP。反应时间为15min。用125I标记的cAMP试剂盒测定AC催化ATP生成的cAMP浓度。每个样品都跟随一个死酶管(加入ATP前，样品在98～100℃水浴下煮3 min，使AC灭活)，以扣除样品本身所含有的cAMP量。AC的活性按1 min、1mg 蛋白质催化产生的cAMP含量计算。用蛋白质含量试剂盒测定蛋白质含量（考马斯亮兰法） 1．4．2 离体肝质膜AC活性的测定 取170～200g的正常SD大白鼠，按前述方法取肝脏匀浆。在反应介质中加入不同浓度的CeCl3，测定质膜AC的活性。 1．4．3 Ce3+培养的肝细胞中cAMP含量的测定 取170～200g的SD大白鼠，按文献方法[7]采用两步循环灌流法分离肝细胞，胶原酶的浓度为0.05%(w/v)。肝细胞纯化分离后，接种于60mm塑料培养皿中。每ml培养液中约含0.5×106个肝细胞，置于CO2细胞培养箱中37℃培养。DMEM培养液中含10 %胎牛血清(v/v)、青霉素(100 kU/L)、链霉素(120 kU/L)、胰岛素(10-7 mol/L)和地塞米松(10-6 mol/L)等。8 h后第一次换培养基，24 h后用含CeCl3和茶碱的培养基培养。培养24 h后用0.25%胰蛋白酶(w/v)消化，按文献方法[4]将细胞破碎，离心取上清液。用125I标记的cAMP试剂盒测定cAMP浓度。
图1 Ce3+对饲养大白鼠AC活性的影响n=6，平均值±标准偏差 |  | 图2 Ce3+对离体大白鼠肝AC活性的影响n=6，平均值±标准偏差
2 实验结果 2.1 Ce3+对整体动物肝质膜AC活性影响 图1表明，大白鼠在用含Ce3+饲料喂养一年后，肝脏质膜AC的活性均较对照组低，低浓度组间变化不大，但较高浓度(320 mg/kg)组AC含量又升高。表明Ce3+对细胞质膜AC有一定的抑制作用，但这种抑制作用并不随Ce3+的浓度加大而上升，反而在高浓度AC活性有所恢复。 2.2 Ce3+对离体肝质膜AC活性影响 图2表明，同对照组相比，低浓度的Ce3+都能使肝脏质膜AC活性显著降低。Ce3+为0.05mmol/L时AC活性最小，然后随Ce3+浓度增大逐渐上升。表明Ce3+对细胞质膜AC的作用是先抑后扬，即抑制作用先随Ce3+的浓度增加而下降，然后随浓度增大至一定程度反而显著地上升，说明高浓度Ce3+可显著恢复AC活性。
图3 Ce3+对培养肝细胞内cAMP含量的影响n=5，平均值±标准偏差 a—control b—0.1mmol/L Ce3+ c—0.1mmol Ce3++1 mmol/L theophylline d—1 mmol/L theophylline
2.3 Ce3+对培养的肝细胞中cAMP含量的影响 在细胞内，cAMP的含量取决于AC的活性和的cAMP-PDE的活性。若用茶碱抑制cAMP-PDE的活性，从而抑制cAMP-PDE的水解，则cAMP的含量就取决于AC的活性。图3表明，当加入终浓度为1 mmol/L茶碱时，由于cAMP-PDE的活性被抑制，cAMP不被cAMP-PDE 水解，因而cAMP含量增加；当加入终浓度为0.1 mmol/L Ce3+时，由于稀土元素并不直接抑制cAMP-PDE的活性[8]，因而cAMP含量的增加只能来源于AC活性的增加；同时加入茶碱和Ce3+，肝细胞内的cAMP含量显著增加，再次表明Ce3+导致的cAMP含量增加是由于AC活性的增加，而不是由于Ce3+对cAMP-PDE活性的抑制。由于AC的活性是由细胞膜上的受体控制[3,4]，而在正常情况下，稀土离子不能进入细胞内[1,2]，因此上述结果提示Ce3+可能通过刺激膜上受体而激活AC，导致肝细胞内cAMP含量增加。 3 讨论 在对马精子和人血小板的研究中，La3+能抑制AC的活性，且随La3+的浓度增加，抑制作用增强；而La3+能促使cAMP含量增加，且cAMP含量随La3+浓度增加而增加，这两者显然是矛盾的[9,10]。本实验室的工作表明：Ce3+可使大白鼠原代肝细胞内的cAMP含量随Ce3+浓度增加而增加，并可促使原代肝细胞中DNA含量增加[11]；整体动物实验表明，Ce3+长期暴露(一年)的大白鼠肝脏内cAMP含量随Ce3+浓度增加而增加（另文发表），提示Ce3+可能使AC的活性增加。文献[12]表明，外加cAMP和茶碱可促进肝细胞的增殖，且cAMP对触发肝细胞内DNA的合成是必不可少的，这就说明Ce3+能够通过cAMP信号系统产生生物效应。本文工作表明，低浓度的Ce3+能抑制肝质膜AC的活性，而高浓度的Ce3+可使AC活性有所恢复；此外，稀土元素可以作为人造腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP的催化中心[13]，这就表明Ce3+有通过细胞膜受体激活质膜AC的可能。对于破碎细胞膜，Ce3+可能分别作用于细胞膜受体的抑制区域和激活区域，低浓度作用于抑制区域，而高浓度则进一步作用于激活区域。用Ce3+培养肝细胞，加入cAMP-PDE的抑制剂茶碱可使细胞内cAMP含量显著增加，说明对于完整细胞，Ce3+可能通过刺激膜上受体促进质膜AC的活性。根据我们的实验结果和文献，我们认为稀土元素可能通过cAMP信号系统而产生生物效应。即稀土元素以第一信使的形式作用于细胞膜受体，然后通过膜受体激活质膜AC；活化的质膜AC催化ATP产生第二信使cAMP，使细胞内cAMP含量增加；cAMP含量增加一方面可促进细胞内DNA含量增加，另一方面可促进糖原分解，从而为细胞的增殖和运动提供物质基础和能量基础[3,4,11]。高浓度的稀土元素由于对细胞膜的过度刺激，从而产生过量的cAMP信号，过度抑制糖原合成而表现出毒性，阻碍生物的生长与发育。动物实验表明，长期用高浓度的稀土元素喂养大白鼠，生长发育则受到阻碍[1]。因此，我们认为稀土元素对cAMP信号系统的影响可能是稀土元素生物效应机理之一。稀土元素生物效应的普遍规律是低浓度的稀土元素促进动植物的生长和发育，而高浓度的稀土元素则抑制动植物的生长和发育[1]，其实质则可能是稀土元素对cAMP信号系统的的刺激和过度刺激的结果。 4 参考文献 [1] 倪嘉缵 主编。 稀土元素生物无机化学。 科学出版社，1995 [2] 杨频,魏春英。稀土与细胞、器官、组织的作用及其生理效应。化学通报,1996,(7):14-17 [3] 孙大业，郭艳林，马力耕编著。 细胞信号转导。 科学出版社，1998 [4] 林曙光，郑广华，段小贝主编。 细胞信号转导系统基础医学与临床。 天津科学技术出版社， 1996 [5] 林明栋，曾熙兰，胡本荣。柴胡分离组分对腺苷酸环化酶的影响。中药药理与临床 1991,7(4):17-20 [6] 张书岭，尹桂山。组织匀浆腺苷酸环化酶的简易测定方法。河北医学院学报，1991,(2):18-20 [7] Erin G S, Donna Li, Omicinski, et al. Regulation of gene expression in adult rat hepatocytes cultured on a basement membrane matrix. Journal of cellular physiology. 1988,134:309-323 [8] Jeanne M Buccigross, Kathleen E McDonald. Lanthanide inhibition of 5’-nucleotidase in the phosphodiesterase assay of calmodulin. J Alloys and Compounds, 1992, 180: 357-362 [9] Leonard C Best, Elisabeth A Bone, Peter B Jones, et al. Lanthanum stimulates the accumulation of cyclic AMP and inhibits section and thromboxane B2 formation in human platelets. Biochimica et biophysica Acta, 1980, 632:336-342 [10] Mary K Gross, Diane G Toscano, and William A Toscano, Calmodulin-mediated adenylate cyclase mammalian sperm. The Journal of Biologic Chemistry, 1987, 262(18):8672-8676 [11] 申治国，雷衡毅，杜柳涛等。铈对培养肝细胞的影响。中山大学学报，1999，38(3):109-112 [12] Miyaiaki M, Wahid S, Bail L, et al. Effects of intracellular cyclic AMP and cyclic GMP levels on DNA synthesis of young-adult rat hepatocytes in primary culture. Exp cell Res. 1992,200(2):404-409 [13] Yajima H, Sumaoka J, Miyama S, et al. Lanthanide ions for the first non-enzymatic formation of adenosine 3',5'-cyclic monophosphate from adenosine triphosphate under physiological conditions. J Biochem Tokyo. 1994 ， 115(6): 1038-1039 申治国 男，35岁，博士研究生，从事稀土生物无机化学研究 国家自然科学基金(29671034)和广东省自然科学基金(960048)资助项目 99-02-03收稿