The Preparation of Biology Membrane Model Systems and the Development of T heir Electrochemical Studies Cui xiaoli a,b, Li junxinb, Jiang dianlub, Diao pengb, Tong rutingb,Wang xinkuia (a:Institute of Coal Chemistry,Chinese Academy of Science, Taiyuan, Shanxi 030001 People's republic of China ) (b:Department of Chemistry, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016) Abstract The preparation of membrane mimetic systems including bilayer lipid membrane(BLM), self-assembling bilayer lipid membrane on solid support(S-BLM),the supported hybrid bilayer membrane consisting of thiol and phosph o lipid(HBM) and their applications in transmembrane electron transfer are described. The applications of self-assembled monolayers(SAMs) as biological model system in the studies of the electron transfer mechanism across biomembrane are also reviewed. Keywords Biomembrane,Bilayer lipid membrane,Hybrid bilayer membrane,Self-assembled monolayers,Electrochemistry 摘要 概述了生物膜模拟体系包括双层类脂膜（BLM）、固体支撑的自组装双层类脂膜（S-BLM）、固体支撑的混合双层膜（HBM）的制备及其在电子转移方面的应用。对自组装单分子膜（SAMs）模拟生物膜的电化学研究也进行了综述。 关键词 生物膜 双层类脂膜 混合双层膜 自组装类脂膜 电化学 生物膜模拟体系的制备及电化学研究进展 崔晓丽 a,b 蒋殿录 b 李俊新 b 刁 鹏 b 童汝亭 b 王心葵 a （a 中国科学院山西煤炭化学研究所 太原 030001 b 河北师范大学化学系 石家庄 050016） 生物膜在生命过程中起着十分重要的作用，生物体系中的许多过程发生在生物膜上。人和动物的代谢作用以及各种生理现象处处都有电流和电势的变化产生，生物电的起因可归结为细胞膜内外两侧的电势差；生物体系中有关能量的传递以及其他一些过程多与生物膜上的电子转移和氧化、还原过程有关。要认识生命现象，首先必须搞清发生在生物膜上的过程。膜体系的电化学研究具有十分重要的意义。但是，由于生物膜的组成、结构、功能的复杂性，在原位进行现场的观测和研究是十分困难的。因此，在实验室制备其模拟体系是进行各种研究的基础和前提。本文介绍了生物膜模拟体系包括 BLM，S-BLM、HBM 以及 SAMs 的制备及它们在膜的电子转移方面的应用。 1 BLM的制备及应用 在50年代，人们公认类脂双层是生物膜的基本结构；60年代初，Muller,P.[1]等成功地在两个水溶液之间形成人工自组装平板双层类脂膜(Planner Bilayer Lipid Membrane,BLM)，并把它作为神经膜的实验模型系统。此后，双层类脂膜、及以后发展起来的球形脂质体广泛地作为许多生物膜的模型。它们的制备方法可见诸多书刊[2-4]，而且至今无大的变化。这种脂双层结构的形成是由类脂分子的两亲性质决定的，类脂分子的一头是疏水碳氢链，另一头是亲水的极性基团，在水相中，这种分子结构使它们自动地组装成双层构型。从此，有关膜的离子运送[5]、光电转换[6-8]、电子传递[9-15]及在传感器的应用等方面的研究迅速开展起来。 生命体系中的细胞膜把细胞内界和外界两个水相分开，所以这种平板BLM与生命体系中的细胞膜最为相近，因此，在平板BLM上的有关研究一直经久不衰，直到90年代，仍有许多报道。这里主要简单介绍BLM在电子转移方面的研究。 在早期，人们测定了BLM的电学参数（电容、电阻等），并将各种光敏物质嵌入膜中，研究其光电转换性质，用来模拟绿色植物的光合作用。从80年代，学者们把电化学方法引入膜的研究中，推动了BLM研究的深入开展。1984年，Tien[13]首次将循环伏安方法用于双层类脂膜体系中的电子过程的研究。其基本的前提是，修饰的BLM可当做电子导体作为工作电极。随后，Tien等[14]应用阶跃法研究了将含TCNQ的BLM作为电极时，抗坏血酸与K3Fe(CN)6之间的电子传递反应，测得了电荷转移的速率常数及电活性物质的扩散系数。1993年，日本学者[11]应用电化学交流阻抗技术测定了被TCNQ-BLM隔开的Co(phen)32+/3+及Fe(CN)63-/4-两体系的电子转移速率常数，给出了膜体系的等效电路图，发现TCNQ能够大大降低膜电阻、电子转移速度与水相中放电离子的电性、脂溶性、及式量电位有关，没有给出电子在膜中的传递机理。1996年，Cheng等[12]报道了以泛醌为媒介体的电子跨膜传递的研究结果。在所研究的电势范围内，循环伏安扫描看不到氧化还原峰的出现，而且电子跨膜传递的速率取决于溶液中氧化还原电对的电势，整个过程的速控步不是界面上电子的转移而是媒介体在膜内的迁移过程，如同紫精在泡囊中的电子传递行为一致。我国学者也对TCNQ-BLM进行了研究。汪尔康等人[10]和高小霞等人[15]分别报道，电子的跨膜传递受膜内电活性物质即TCNQ的扩散所控制。 尽管以平板BLM为生物膜的模型开展了许多研究，取得了一些很有意义的结果，但是，在两个分隔的水相之间所形成的双层脂膜极不稳定，这是BLM的最大弱点，为了提高它的稳定性，人们进行了许多新的尝试，创造了固体支撑的自组装双层类脂膜（S-BLM）、及支撑的混合双层膜（HBM）。 2 固体支撑的自组装双层类脂膜（S-BLM）的制备与特性 1989年，Tien等[16]发现，可在金属 (包括Pt、Ag等) 的新生表面上自组装形成BLM， 而且其稳定性得到很大改善。类脂分子与新劈开的金属表面接触，具有两亲基团的类脂分子将在剖面上发生定向吸附，其极性基团不可逆地结合到金属表面，疏水的非极性基团指向有机相；当转移到水相中时，类脂分子再次在有机相/水相界面上取向，自组装形成双层类脂分子膜。图1示出S-BLM的形成过程[16]。这种固体支撑的自组装双层类脂膜(Self-Assembling Bilayer Lipid Membrane on Solid Support,S-BLM)的提出，使有关BLM的研究进入了一个新的阶段，特别是为生物传感器的研究奠定了基础[17,18]。 图 1 固体支撑的双层类脂膜的形成示意图 圆圈表示类脂分子的极性头，曲线表示类脂分子的疏水的碳氢链 (a) (b) (c) (d) 表示自组装过程 S-BLM的提出，为电化学方法的应用提供了更加便利的条件。将具有电子传递功能的化合物嵌入S-BLM中，修饰后的S-BLM可以作为电极使用，与其它电极组合，形成一个固体支撑的双层脂膜研究体系，该体系既能保持双层脂膜的自组装、超薄(6～10nm)、易于形成等优点，又具有较好的稳定性，应用电化学手段，可以获取有关电子跨膜传递的重要信息。1991年，Z.Salamon等[19,20]报道了以乙烯基二茂铁为电子媒介体的Au-BLM上细胞色素c的还原反应。测定了细胞色素c在BLM表面的吸附平衡常数及电子转移速率常数，发现总的反应速率由细胞色素c向电极表面的扩散过程所控制，这与邰子厚等报道的二茂铁及其衍生物修饰的铂支撑双层脂膜对抗坏血酸电催化氧化行为一致[21]。这实质上相当于"薄膜修饰电极"[22]，媒介体直接与电极表面相接触，说明形成的S-BLM有较多的缺陷[23]。1996年，Tien 等[24]报道了嵌有泛醌等辅基的S-BLM的CV行为，从循环伏安图可以推测，S-BLM有严重的缺陷。 制备S-BLM的关键是基底的更新与平整。文献中大多采用切割的方法来获取新鲜的表面。这虽然能够保证基底的新鲜，但是，却很难保证有一个原子级平整度的基底，导致S-BLM有严重的缺陷，这是S-BLM的致命之处。因此，应用S-BLM来研究电子的跨膜转移，遇到了极大的困难。 3 SAMs模拟生物膜的电化学研究 自组装单分子膜（Self-Assembled Monolayers,SAMs）是分子在溶液（或气态）中自发通过化学键牢固地吸附在固体基底上而形成的，硫醇自组装单分子膜(SAMs)是最有代表性和研究最多的体系，其制备方法非常简单，自组装膜的基底是通过真空蒸镀的办法制得的。一般的步骤是，先在单晶硅或玻片上覆盖 15nm 铬做粘结层，然后蒸镀 150nm-200nm 的金。基片在 Piranha 溶液(浓 H 2 SO 4/30%H 2 O 2,V/V=7:3)中浸泡，依次用二次水、无水乙醇冲洗，立刻浸入硫醇的组装液中。硫醇分子在金表面进行自组装，一般约 24 小时后可形成自组装单分子膜（图 2）[25]，从组装液中取出，再依次用无水乙醇、二次水冲洗，以除去表面物理吸附的分子，然后用高纯氮气吹干表面溶剂，可立即进行电化学研究或其他测试。由这种简单方法构造的有序分子膜，不但具有传统 LB 膜的有序性，同时还具有较高的稳定性，易于应用近代物理和化学的表征技术进行研究，因而这种新型超薄有机膜得到重视，迅速成为界面化学、材料科学等许多领域的研究热点[25-28]。这里仅着重概述 SAMs 模拟生物膜的电化学研究[27]。
图 2 SAMs 成膜过程示意图 圆圈表示硫醇分子的巯基，曲线表示硫醇分子的碳氢链
分子自组装修饰电极可按预先设计在电极表面形成具有特殊功能的单分子层结构，这对仿生界面的研究有重要意义，因为它在分子尺寸、组织模型和膜的自然形成方面与天然生物膜有类似之处，同时，它具有分子识别功能和选择性响应。可用SAMs表面分子的选择性来研究蛋白质的吸附作用，将电活性的蛋白质接在SAMs的末端，这样一方面能消除在电化学测量中质量传递的影响，另一方面可调节硫醇链的长度以控制蛋白质的活性中心与电极之间的距离。 Bowden等[29]研究了细胞色素c(Cytc)在ω-羧酸烷基硫醇化合物修饰金电极上的电子转移动力学和电子转移机理，得到Cytc的表面式电势为+215mV（vs NHE），接近于它在生理膜上的电势值。随后，他们[30]又研究了细胞色素c与硫醇修饰金电极间电子转移的速率常数的分布问题，发现在较小过电势时，电化学反应的总速率常数的大小取决于电子受体与给体的距离、重组能及式量电位的指数。Arnold 等[31]应用烷基硫醇和羧基硫醇组装混合自组膜，发现由于烷基硫醇的稀释作用，使得吸附的细胞色素c的电子转移更加容易。Wen等[32]研究了细胞色素c与NADPH-细胞色素c P450还原酶之间的电子转移，发现当细胞色素c处于溶液中或静电吸附在电极表面时，可以观测到与NADPH-细胞色素c P450间的快速电子转移，如果将细胞色素c共价键合在电极表面，尽管与电极发生准可逆的电子交换，但没有观测到与NADPH-细胞色素c P450间的电子转移，说明细胞色素c分子的取向对电子转移有非常重要的作用。 陈洪渊等[33]研究了多巴胺在硫堇衍生化自组膜修饰金电极上的伏安行为，发现峰电流与多巴胺浓度呈线性关系，可用于多巴胺的灵敏测定。Mukae等[34]研究了固定在氨基硫醇的SAMs表面的萘醌（Naphtoquinone）的伏安行为。发现硫醇的链长对电子转移有较大影响，测定了不同链长时的速率常数。用硫醇化合物在金上的SAMs膜为基体研究氧化还原蛋白质中的长程和界面电子转移动力学以及生物活性物质的性质，这比在裸电极上得到的数据更接近生物体系，这方面的研究工作预计今后将会有更大的发展。 SAMs在酶的固定化及其生物电化学研究中也有很好的应用。Kinnear等利用SAMs研究了大肠杆菌延胡索酸还原酶的电化学，Porter和Murray分别报道了卟啉衍生物SAMs对氧还原的电催化作用，董献堆研究了葡萄糖氧化酶在SAMs上的固定化及其催化行为，并研究了DNA与SAMs间的相互作用[35]。Monbouquette[36]将反丁稀二酸还原酶包埋于硫醇SAMs中，仍具有生物活性并能进行直接电子转移，由于在反丁稀二酸溶液中具有灵敏的阴极电流响应，有可能进一步发展成为新型传感器和生物催化器件。 Li等[37]研究了细胞色素c氧化酶在3-巯基乙酸(MPA)修饰金电极上的直接电子转移。CV测试结果表明，细胞色素c氧化酶与电极间的电子转移是一个无扩散的快速过程。3-巯基乙酸(MPA)即是电极修饰剂又是使细胞色素c氧化酶保持一定的取向不发生变性的桥梁分子。这种Au/MPA/ 细胞色素c氧化酶体系能够催化溶液中的细胞色素c的氧化与还原，该体系可望成为无媒介剂的第三代生物传感器。Razumas等[38]研究了过氧化物酶（MP-11）在4,4'-二硫联吡啶及十烷基硫醇修饰的CV金电极行为。测得了在4,4'-二硫联吡啶修饰的金电极上的速率常数，在十烷基硫醇修饰的金电极上，认为电子转移发生在膜的缺陷处，还讨论了（MP-11）的氧化还原机理。 SAMs是研究生物膜电子传递也是研究膜的离子渗透模拟体系的重要组成部分。一些有机化合物如泛醌（UQ0），黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）[39]，蛋氨酸[40]等生物小分子在溶液中可以渗透SAMs而在电极上进行电子交换反应。可以用SAMs来模拟生物小分子在生物膜内的输运和代谢过程。由于SAMs良好的稳定性及容易制备等特点，在生物膜模拟方面研究会有较大的发展，但是，SAMs与实际的生物膜的构造相差较远，只有实际的生物膜的一半，因此，在SAMs的基础上，人们又创造了混合双层膜（HBM）。 4 固体支撑的混合双层膜（HBM）的制备与特性 随着SAMs的研究的不断深入，人们认识到烷基SAMs具有疏水性的表面，同时硫醇的S与Au之间有强烈的化学键吸附，利用SAMs作为固体基底构造双层膜，可以用来模拟天然双层膜的基本结构。目前文献中已有通过LB[41-46]的方法，刷涂自组装的方法[46-48] ，泡囊融合的方法[49,50]，刷涂-冷冻方法[46]，在SAMs上沉积磷脂构造双层膜。这种内层为硫醇，外层为磷脂的双层膜可称为混合双层膜（Hybrid Bilayer Membrane, HBM）（图3）[50]。HBM结合了SAMs的优点，在结构上与天然生物膜相似，可望进一步发展成为新型的传感器和生物催化器件。此外，对于含特定端基（如-COOH, -NH2,等）的巯基化合物形成的SAMs，可以通过化学反应使暴露在外面的活性基团键接上一个新分子，形成第二单分子层，这种操作也可以多次进行，直到得到特定功能的外表面层，这种衍生化的方法为制备纳米级功能修饰层提供了更多的灵活性[34,51-55]。这里重点概述前者。
图 3 混合双层膜 HBM 的示意图
最初人们用支撑的HBM模拟细胞膜来研究膜的表面性质及表面相互作用，更加实际的是用途是构造生物传感器。1993年，Stelzle等应用交流阻抗技术研究了支撑的HBM用于生物传感器器件的可能性[41]。他们用两种方法制备HBM，一是用烷基硫醇制备疏水性的基底，用LB技术沉积磷脂膜。二是制备亲水性的羧基硫醇的单分子膜基底，再把磷脂泡囊融合在带电的膜表面。Plant[49]也通过泡囊融合的方法在烷基SAMs上构造稳定的无溶剂的混合双层膜，通过交流阻抗方研究了这种双层膜对溶液中的电活性物质的电子转移性质，结果表明，这种双层膜无针孔缺陷，电子转移由隧穿过程完成。最近，Plant[50]又应用表面增强拉曼光谱（SERS）及反射吸收红外光谱（RAIRS）研究了通过泡囊融合的方法在SAMs上构造稳定的无溶剂的混合双层膜（HBM）的分子结构。发现烷基硫醇表面的类脂分子将发生倾斜，同时发现HBM的形成将使SAMs更加有序。 目前对于嵌有电活性物质的混合双层膜的研究也有报道，Laval等[44]应用组装在金电极上的18烷基硫醇为基底，通过LB技术用DPPC组装双层膜，并将泛醌（Q10）嵌入双层膜中，应用CV技术研究了其电化学行为。发现电化学响应是由泛醌扩散到烷基硫醇膜的缺陷处产生的。Gao等[43]将烷基硫醇组装在金电极表面，然后用LB的方法再在硫醇单分子膜表面构造一层16-二茂铁基-十六酸双层膜，二茂铁基团完全处于双层膜之间，循环伏安扫描看不到二茂铁的氧化还原电流，原因是反离子不能渗透。Liu等[45]将半胱胺自组装在金电极上，通过LB的方法依靠羧基与氨基间的静电作用，构造带有烷基及羧基的偶氮苯双层膜，发现分子间的氢键影响膜的稳定性及其电化学行为。 根据文献中报道的三种常用的双层膜体系在电子转移方面的研究状况，BLM虽与实际的生物膜最为接近，但稳定性差限制了其应用；S-BLM具有良好的稳定性但存在较多缺陷；因此，我们认为HBM是目前研究电子跨膜转移的最理想体系。纵观文献中对HBM用于电子转移的研究，目前尚处于起步阶段。将不同的电子媒介体嵌入膜中，研究其电子传递的机理，预计今后将会有较大的发展。自组装单分子膜（SAMs）具备稳定性好及容易制备等显著的优点和广泛的应用前景，在生物膜模拟方面研究也会继续得到重视和深入。 5 参考文献 [1] Muller P, Rudin D O, Tien H T et al. Nature, 1962, 979 [2] 田心棣 著, 肖科 译. 人造双分子层膜, 北京: 高等教育出版社, 1987 [3] [美]Fendler J H 著, 程虎民, 高月英 译. 膜模拟化学, 北京: 科学出版社, 1991 [4] 张志鸿, 刘文龙 编著. 膜生物物理学, 北京:高等教育出版社, 1987 [5] 裴真明, 汤真诚. 科学通报, 1994, 39(15): 1416 [6] Xiao Y J, Gao X X, Xei G Y et al. Bioelectrochem. Bioenerg., 1996, 39: 125 [7] Hwang K, Mauzerall D. Nature, 1993, 361(14): 138 [8] Spassova M, Petrov A G, Fendler J H. J. Phys. Chem., 1995, 99: 9485 [9] Ottova A L, Tien H T, Bioelectrochem. Bioenerg., 1997, 42: 141 [10] 丁林, 汪尔康. 科学通报, 1996, 41(16), 1481; 丁林, 汪尔康. 物理化学学报, 1997, 13(4): 362 [11] Yamada H, Shiku H, Matsue T et al. J. Phys. Chem., 1993 , 97: 9547 [12] Cheng Y, Cunnane V J, Kontturi A K et al. J. Phys. Chem., 1996, 100: 15470 [13] Tien H T. J. Phys. Chem., 1984, 88: 3172 [14] Krysinski P, Tien H T. Bioelectrochem. Bioenerg., 1988, 19: 227 [15] 肖以金, 高小霞, 容寿榆. 科学通报, 1994, 39(1): 46 [16] Tien H T, Salmon Z. Bioelectrochem. Bioenerg., 1989, 22: 211 [17] Tien H T, Wurster S H et al. Bioelectrochem. Bioenerg., 1997,42: 77 [18] Nikolelis D P, Siontorou C G. Bioelectrochem. Bioenerg., 1997, 42: 71 [19] Salmon Z, Tollin G. Bioelectrochem. Bioenerg., 1991, 25: 447 [20] Salmon Z, Tollin G. Bioelectrochem. Bioenerg., 1991, 26: 321 [21] 邰子厚, 李 屯, 杨昌正. 生物化学与生物物理进展, 1992, 5: 391 [22] 董绍俊, 车广礼, 谢远武. 化学修饰电极 北京: 科学出版社 1995; 吕紫玲, 董绍俊. 化学学报, 1986, 44: 32 [23] Wardak A, Tien H T. Bioelectrochem. Bioenerg. 1990, 24,1 [24] Murgasova R, Sabo J, Ottova A L, Tien H T. Smart Mater. Struct., 1996, 5: 348 [25] 邓文礼, 杨林静, 王 琛, 白春礼. 科学通报, 1998, 43(5): 449 [26] Ulman A. Chem. Rev., 1996, 96 : 1533 [27] 李景虹, 程广金, 董绍俊. 分析化学, 1996, 24(9): 1093 [28] 李景虹, 程广金, 董绍俊. 化学通报, 1995, 10: 11 [29] Song S, Clark E F, Bowden E F. J. Phys. Chem., 1993, 97: 6564 [30] Nahir T M , Bowden E F. J. Electroanal. Chem., 1996, 410, 9 [31] Arnold S, Zhi Q F, Kakiuchi T et al. J. Electroanal. Chem., 1997, 438, 91 [32] Wen Jin, Wollenberger U, Kargel E et al. J. Electroanal. Chem., 1997, 433: 135 [33] 徐静鹃, 汪 云, 方惠群, 陈洪渊. 分析化学, 1998, 26(4): 428 [34] Mukae F, Takemura H, Takehara K. Bull. Chem. Soc. Jpn., 1996, 69: 2461 [35] 卢基林, 庞代文. 大学化学, 1998, 13: 30 [36] Kinnear K T , Monbouquette H G. Langmuir, 1993,9: 2255 [37] Li J H, Cheng G J , Dong S J. J. Electroanal. Chem., 1996, 416: 97 [38] Razumas V, Arnebrant T. J. Electroanal. Chem., 1997, 427: 1 [39] Takehara K, Takemura H, Ide Y. J. Colloid Sci., 1993, 156: 274 [40] 聂孟言, 力虎林. 兰州大学学报(自然科学版), 1998, 34(1): 56 [41] Stelzle M, Weissmuller G, Sackmann E, J. Phys.Chem., 1993, 97: 2974 [42] Gregory B W, Dtuhy L A, Bottomey. J. Phys. Chem., 1994, 98: 1010 [43] Gao L H , Facct J S, Mclendon G. J. Phys. Chem., 1995, 99: 4106 [44] Laval J M, Madja M. Thin Solid Films, 1994, 244: 836 [45] Zhao C X, Zhang J, Liu Z F. Chem. Lett., 1997 , 473 [46] Ding L, Li J, Dong S. J. Electroananl. Chem., 1996, 416: 105 [47] Florin E L, Gaub H E. Biophys. J., 1993, 64 : 375 [48] Seifert K, Fendler K, Bamberg E. Biophys. J., 1993, 64 : 384 [49] Plant A L, Gueguetchkeri M, Willian Y. Biophys. J., 1994, 67 : 1126 [50] Meuse C W, Niaura G, Lewis M L, Plant A L. Langmuir, 1998, 14: 1604 [51] 董献堆, 陆君涛, 查全性. 电化学, 1995, 1(1): 25 [52] Yu H Z, Zhao J W, Liu Z F et al. Chem. J. Chim. Univ., 1995, 16: 138 [53] Katz E, Schmidt H L. J. Electroanal. Chem., 1994, 368: 87 [54] 徐静娟, 方惠群, 陈洪渊. 高等学校化学学报, 1997, 18(5): 706 [55] 候士峰, 杨可盛, 方惠群, 陈洪渊. 物理化学学报, 1998, 14(7): 640 98-10-19 收稿