Pulsed Field Gradient in High Resolution NMR Li Guangyu (National Center for Biomedical Analysis, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850) Abstract The technique of pulsed field gradient (PFG) as element of pulse sequence is one promising development in NMR recently. Applying PFG by means of selecting coherence pathway, acquisitive time can be dramatically saved, and unwanted signals such as the water peak and T1 noise were effectively suppressed. Therefore for its poor sensitivity and low signal intensity, PFG has become very popular in 2-D and multi-dimensional NMR experiments. Key words High resolution NMR, Pulsed field gradient, Pulse sequence, Selection of coherence pathway 摘要 介绍了核磁共振波谱中脉冲梯度场技术的相干选择作用。介绍该方法在二维谱和多维谱中的应用，以及该方法的优越性和在实验中应注意的问题。 关键词 高分辨核磁共振 脉冲梯度场 脉冲序列 相干选择 核磁共振波谱中的脉冲梯度场技术 李光玉 (军事医学科学院国家生物医学分析中心 北京 100850) 脉冲梯度场（Pulsed field gradient，PFG）技术在高分辨核磁共振（NMR）实验中的广泛应用，近几年最引人注目，同时发展也极为迅速[1][2]。PFG在磁共振成像（MRI）中早已是常规方法，1990年R.E.Hurd把它和脉冲序列结合起来，用于选择相干路径，开始了它在高分辨NMR中的应用[5]。 1 梯度场的作用[3,4] 1.1 PFG的散相和聚相作用 在核磁共振实验中为得到谱线狭窄、分辨良好的谱图，一般情况下我们需要磁场有很高的均匀性；如果磁场不均匀的话，谱线就会变宽，甚至单峰会变成多重峰，致使信号无法分辨和解析。 在PFG作用下，磁场不再是均匀的。我们考虑PFG作用于Z轴（即和静磁场平行）的情况。在梯度场脉冲（图1（1）中第一个梯度脉冲（梯度为G，脉冲宽度为t见图１(1)(a))作用下，静磁场内各部分不再是均匀的，在Z轴方向上形成一个倾角为q的磁场梯度（图1（2））。这时信号的磁化矢量被均匀散开，磁化矢量之和为零，因此观测不到信号。这种现象称为PFG的散相作用（dephase），见图1（3）（b）。该脉冲散相作用的程度用 来表示。我们可以利用散相作用以消除不想要的信号。 如果在第一个梯度脉冲作用后，紧接着又作用第二个脉冲，该脉冲和第一个脉冲完全一样，只是符号相反(梯度为-G，脉冲宽度为 t见图１(1)(b))，则这两个脉冲产生的散相作用相互抵消，磁化矢量重新聚相，又可以观测到信号。PFG这种作用称为聚相（rephase），见图1。通过聚相作用使散相了的信号重新聚相、得到检测。 图 1 PFG的散相和聚相作用 (1) 脉冲序列 (2) 由于FG作用Z轴方向形成的磁场梯度 (3) 对应于(1)时间点(a),(b),(c)磁化矢量在XY平面上的投影 1.2 PFG的相干选择 PFG的作用还不止这些。我们把梯度场脉冲和射频脉冲结合起来，可以使某种特殊的磁化矢量成分聚相、得到检测，即可以进行磁化矢量的相干选择。一般情况下，梯度场的梯度为G、脉冲宽度为t，磁化矢量成分的相干级数为P，则散相作用的大小为PgGt ，如果满足下面条件，则该磁化矢量成分就会聚相并得到检测： 我们以FG-COSY序列为例作一说明。图2为FG-COSY的脉冲序列和相干路径的示意图。如果G1=G2，相干路径为（0® +1® -1）的N型信号得到检 图 2 FG-COSY脉冲序列和相干路径的示意图 测，相干路径分别为（0-> 0->-1）与（0-> -1-> -1）的Z和P型信号，由于不能满足上述公式则不能被观测。如果G1=-G2，同样由于上述原因，得到检测的是P型信号。常规方法需要多次扫描，进行相位循环才能选择的信号（譬如本实验中的N型或P型信号），采用PFG只进行一次扫描就足够了。 1.3 PFG硬件组成 PFG由以下几部分组成。 1.梯度控制单元：用来产生各种梯度脉冲。 2.梯度电流放大器：采用高稳定的直流放大器，可提供数安培至数十安培的电流输出。 3.装配有自屏蔽梯度线圈的探头：采用自屏蔽设计，以最大限度地减小梯度脉冲所产生的涡流。这种线圈由内外两个线圈组成，靠内的线圈产生所需的梯度场，靠外的线圈则抵消掉在探头上产生的涡流。 梯度场一般使用半正弦波形。 2 PFG的优越性及其在多维谱中的应用[4] PFG由于以下的优点而在二维谱及多维谱中得到广泛应用。 2.1 减少累加次数 常规方法中需要的相干选择，是通过多次累加扫描、进行相位循环实现的。这样，即使样品浓度很高，最少的累加扫描次数也是根据相位循环的需要来决定的。而采用PFG方法，相干路径的选择只需要一次扫描便可得到。因此，只要样品的浓度足够高，就可以把累加的扫描次数减少到最小次数──一次。这样，就可以象一维谱一样，二维谱只需要几分钟就能完成采样工作。 对耗时巨大的三维和多维谱意义特别重要，可以大大节省时间。 2.2 降低t1噪音 多维谱中的t1噪音可以分成下面两种： (1)谱图上有用信号产生的； (2)相干路径选择不完善，应当消除而没能消除的。例如DQF COSY、HMQC/HSQC和HMBC的t1噪音。 对于原因(1)引起的t1噪音，由于没有需要消除的信号成分，不能通过选择相干路径来加以消除。但由于PFG减少了累加次数，大大缩短了采样时间，相应也降低了核磁共振谱仪的不稳定性所产生的干扰和噪音。 原因(2)引起的t1噪音有这样的特点，即和有用信号相比需要消除的信号相当大。例如DQF COSY实验，t1噪音是由信号强度较大的甲基等引起的；又如HMQC/HSQC实验，和12C相连的1H信号的强度（t1噪音）是和13C相连的信号的100倍，而我们需要的却是后一种信号。在PFG实验中，由于我们只选择了有用的相干路径，t1噪音被消除得十分干净。图3是在相同条件下测得的胆固醇的HMBC谱，常规方法中巨大的T1噪音在FG-HMBC中被消除得干干净净。 图 3 胆固醇(10mg/0.3ml)的HMBC谱 2.3 消除溶剂水峰 如果样品浓度较大，正如上面所讨论的，水峰作为T1噪音出现（譬如FG-DQF-COSY或者FG-HMQC，FG-HMBC），由于PFG的相干选择作用，采用一般的PFG脉冲序列就可以被消除得很干净，不用特别处理。 对于蛋白质等生物大分子而言，样品浓度一般都很低（几个mM），通常是把PFG和消水峰的选择性脉冲结合起来[6][7]。该脉冲序列首先选择激发水信号，再加上一个PFG。在T1弛豫作用下，分散开的磁化矢量重新聚焦。如果选择合适的等待时间t ，使样品信号充分恢复，而T1较长的水信号则不能得到恢复，水信号就会被压制掉。 还可以根据水分子的扩散作用，利用PFG来消除水峰。我们知道，PFG观测的是一个回波信号，如果分子在散相和聚相脉冲间发生了扩散，该分子的信号就不会很好地聚相，从而被抑制。和蛋白质分子相比，水分子很小，扩散很快，因此梯度场用来压制水峰十分有效。该方法叫干洗法（Dryclean method）[8]。干洗法可以得到被水峰掩盖及水峰附近的信号，对预饱和、选择性照射等其他方法是一个很好的补充。 消除比其它信号强1万至100万倍的巨大的水峰，对于水溶液中生物大分子结构和构象的研究，有特别重要的意义。 3 PFG的灵敏度问题及注意事项[4] 由于以下原因，FPG实验的灵敏度有不同程度的降低。 第一、由于PFG只能选择一个相干路径，如果常规实验有两个或更多的相干路径的话，灵敏度肯定相应要降低。这是由PFG实验的原理决定的，也是所有PFG实验不可避免的问题。尤其是相敏实验，问题就更突出。 第二、施加PFG时，由于有一定的脉冲宽度，T2驰豫造成了磁化矢量的衰减，使信号强度降低。为减少信号损失，在通常情况下，如果要得到同样的梯度量（譬如，要能足够消除HMQC实验中和12C相连的信号），一般是采用短的脉冲宽度、较强的梯度场，而不是反过来，即增加脉冲宽度、降低梯度场。在观测磁旋比低的核时（譬如1H-15N HMQC实验），要更加注意这个问题。 第三、上面已经讨论过，从某种意义上说PFG观测的是一个回波信号，由于分子的扩散作用，聚相时信号强度下降。散相和聚相的间隔越长，得到信号的灵敏度就越差。一般来讲，梯度场越强信号衰减得越快；并且，分子量越小，溶剂的黏度越小，分子就扩散得越快，信号衰减得也就越快。不过，总的来说，分子扩散在实际实验中的影响还是比较小的。 有一些改进的脉冲序列可以提高检测的灵敏度[9][10]。另外，由于PFG进行相干选择，使谱仪只接收有用的信号而把不要的信号“过滤”掉，谱仪接收机的增益可以达到理想值──不要的信号有时相当大，譬如溶剂信号，这对信号灵敏度的降低是一个补偿。[11] 4 结论 PFG技术利用相干选择，选择有用信号同时“过滤”不想要的信号，从而有效地压制溶剂信号，降低t1噪音，显著改善谱图质量；取代相位循环，大大缩短采样时间，因此，尽管灵敏度有所降低，近几年来在高分辨核磁共振波谱中作为重要的技术手段，得到了广泛应用。[11] 5 参考文献 [1] Dybowski C.et al,Analytical Chemistry,1996,68,161R-168RKay L. E.,Prog.Biophys.Molec.Biol, 1995, 63, 277-299 [2] 冯锐，国外分析仪器，1996，2：22-28 [3] JEOL, Application Note, NM88, NM89 [4] Hurd R E. J. Magn. Reson.,1990,87,422 [5] Hurd R E et al. J. Magn. Reson.,1992,99,632 [6] Jhon B K et al. J. Magn. Reson.,1992,98,200 [7] vanZijl P C M et al. J. Magn. Reson.,1990,87,18 [8] Rinaldi P L et al. J. Magn. Reson.,Ser. A,1994,108,259-262 [9] Kontaxis G et al. J. Magn. Reson.,Ser. A,1994,111,70-76 [10] Berger S. Prog. Nucl Magn Reson. Spec.,1997,30,137-156 1998-07-31 收稿