Influence of Pt(Ⅳ) on the catalytic Activity of Rhus vernicifera Laccase Tu Chuqiao, Liang Hong, Wang Guanghui# (Department of Chemistry, Guangxi Normal University, Guilin 541004 China #College of Chemistry, Wuhan University, Wuhan 430072 China) Abstract Kinetic experiments were performed to study the effects of Pt(Ⅳ) on the oxidation of 5,6-dibromo-2,3-dicyanohydroquinone(DDBQH2) catalyzed by Rhus vernicifera laccase under condition of pH 4.4 and 30±0.2℃. The results showed that the mixed inhibition could be observed when Pt(Ⅳ) was at low concentrations, the competitive and non-competitive inhibition constants were 3.0×10-6 and 7.5×10-6 mol/L, respectively. With the increase of Pt(Ⅳ) concentration, the inhibition was gradually converted into activation which we suggest to be mixed type, and the competitive and non-competitive activation constants were 285.7×10-6 and 62.5×10-6 mol/L, respectively. With the extension of mixed time of Pt(Ⅳ) with laccase, the activation on the laccase activity was obvious strengthened, but the inhibition only went up a little. The absorption spectrum of laccase mixed with Pt(Ⅳ) suggests that it is the type 1 site and type 3 site in laccase with which Pt(Ⅳ) interacts. Keywords Rhus vernicifera laccase , Pt（Ⅳ）, inhibition and activation 摘要 通过动力学方法研究了pH 4.4和30±0.2℃条件下Pt(Ⅳ)对漆树漆酶催化氧化5，6-二溴-2，3-二氰基氢醌（DDBQH2）的影响。结果表明，当Pt(Ⅳ)浓度较低时，它对酶催反应有混合性抑制作用，竞争性和非竞争性抑制剂常数分别为3.0×10-6 和7.5×10-6 mol/L；随着Pt(Ⅳ)浓度的增加，抑制作用逐渐转变为活化作用，这种活化作用暂时被称为混合性活化作用，竞争性和非竞争性活化剂常数分别为285.7×10-6 和62.5×10-6 mol/L。随着Pt(Ⅳ)与漆酶混合时间的延长，Pt(Ⅳ)对漆酶活性的活化作用明显加强，但抑制作用变化不大。与Pt(Ⅳ)混合一定时间后的漆酶的吸收光谱表明，漆酶分子中的Ⅰ型铜位和Ⅲ型铜位可能是Pt(Ⅳ)的作用位点。 关键词 漆树漆酶 Pt（Ⅳ） 抑制和活化 Pt（Ⅳ）对漆树漆酶催化活性的影响 涂楚桥 梁宏** 王光辉# （广西师范大学化学化工系 桂林 541004 #武汉大学化学学院 武汉 430072） 铂不仅是重要的催化剂，也是重要的抗癌元素。目前对铂的各种化合物的研究几乎都集中在抗癌性上，而以Pt（Ⅳ）为效应物考察对酶催化活性影响的报道极少[1,2]。本文以5，6-二溴-2，3二氰基氢醌（DDBQH2）为底物，用分光光度法考察了Pt（Ⅳ）存在下的漆酶催化氧化反应和漆酶的吸收光谱变化，探讨了它对漆酶催化活性的影响。 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 漆酶的分离纯化和底物（5，6-二溴-2，3二氰基氢醌，简称DDBQH2）的合成按文献[3]进行。K2PtCl6，NaNO3，HAc和NaAc均为分析纯试剂。底物溶液用无水乙醇配制，HAc-NaAc缓冲溶液（pH4.4）用去离子水配制，内含0.1 mol∕L NaNO3以维持相同的离子强度。其余溶液均用缓冲液配制。Pt（Ⅳ）溶液避光保存，其浓度用WFX-IF2型原子吸收分光光度计测定。实验均在0.1 mol∕L HAc-NaAc缓冲液（pH4.4）中和(30±0.2)℃条件下进行。 实验所用仪器为岛津UV-240型紫外-可见分光光度计。 1.2 Pt（Ⅳ）对漆酶催化活性的影响 取一定体积的缓冲液于1cm比色皿中，加入一定量的底物和Pt（Ⅳ）溶液，预热达热平衡后，加入一定量的漆酶液（此时比色皿中的溶液总体积为3.00±0.02ml）启动反应。定时追踪反应开始后3分钟内底物特征吸收处（389nm）吸光度值随时间的变化，求出反应初速度v0。 1.3 Pt（Ⅳ）与漆酶混合时间对漆酶催化活性的影响 取一定体积的缓冲液于1cm比色皿中，加入一定量的漆酶液和Pt（Ⅳ）溶液，放置不同时间后，加入一定量的底物溶液（此时比色皿中的溶液总体积为3.00±0.02ml）启动反应。定时追踪反应开始后3分钟内底物特征吸收处（389nm）吸光度值随时间的变化，求出反应初速度v0。 1.4 Pt（Ⅳ）对漆酶吸收光谱的影响 取漆酶液2.0ml，绘制800-290nm范围的吸收光谱图。加入一定量的Pt（Ⅳ）溶液后，再定时绘制漆酶的吸收光谱图。 2 结果与讨论 2.1 对漆酶催化活性的作用 由于Pt（Ⅳ）有较强的氧化性，首先在实验条件下观察了它对DDBQH2的氧化情况。发现在DDBQH2的浓度为1.1×10-3mol∕L，Pt（Ⅳ）浓度大于4.26×10-4 mol∕L时，开始对DDBQH2表现出可以观察到的氧化作用。因此在实验中严格控制[DDBQH2]:[Pt（Ⅳ）] > 2.6:1。 Pt（Ⅳ）对漆酶催化活性的影响表现为抑制和激活两种作用，并与Pt（Ⅳ）的浓度及漆酶和Pt（Ⅳ）的作用时间密切相关。就浓度而言，如图1所示，随着Pt（Ⅳ）浓度的增加，漆酶的催化活性先是被抑制，然后又被激活，最大抑制率和最大激活率[3]分别可达-28%和+50%。就时效性而言，如图2，在抑制区（见图1）内选择一个Pt（Ⅳ）浓度，发现随着Pt（Ⅳ）和漆酶作用时间的延长，抑制率变化不大；在激活区内选择一个Pt（Ⅳ）浓度，发现随着作用时间的延长，激活率明显上升。
图1 [Pt（Ⅳ）]对漆酶催化活性的影响 | 图2 Pt（Ⅳ）与漆酶混合时间对漆酶催化活性的影响
[DDBQH2]：1.1×10-3mol∕L。DDBQH2和Pt（Ⅳ）预孵化12分钟后，加入漆酶启动反应。 | [DDBQH2]：1.1×10-3mol∕L。 [Pt（Ⅳ）]：▲1.07，●28.7×10-6 mol∕L。Pt（Ⅳ）和漆酶预孵化一定时间后，加入DDBQH2启动反应。
2.2 作用特征 在抑制区（见图1）内选择不同的Pt（Ⅳ）浓度测定酶促反应的L-B图，发现Pt（Ⅳ）的抑制作用具有不常见的混合性（竞争性和非竞争性）特征[4]。以L-B图斜率和纵坐标截距分别对[Pt（Ⅳ）]作图[4]，求出Pt（Ⅳ）的竞争性抑制剂常数为3.0×10-6 mol∕L，非竞争性抑制剂常数为7.5×10-6 mol∕L。 图3是在较高的Pt（Ⅳ）浓度（图1中活化区）下酶促反应的L-B图。图中情形类似于混合性抑制[4]，不同之处是在图3中，随着Pt（Ⅳ）浓度的增加，直线的斜率逐渐下降，与混合性抑制的情况正好相反。由于迄今尚无一种合适的机理可用于解释这种实验结果，我们参照酶的抑制作用的处理方法，暂时称之为混合性活化，其双倒数方程为： 1/v0 = 1/ V’max + K’m /(V’max·[DDBQH2]0) (1) K’m 和V’max分别定义为： K’m = Km {1+ (Ka/[A0])} /{1+(KA/[A0])} (2) V’max = Vmax /{1+ (KA/[A0])} (3) 其中v0是酶促反应的初速度，Ka和KA可理解为竞争性和非竞争性活化剂常数，[A0]是Pt（Ⅳ）的起始浓度，[DDBQH2]0是底物的起始浓度。图3中各直线的斜率（K’m/V’max）可用式（4）表示： K’mVmax/KmV’max = 1+ (Ka/[A0]) (4) 图3中各直线的斜率对相应的Pt（Ⅳ）浓度的倒数作图为线性，在横轴上的截距即为-（Ka）-1。从图4（a）可得Ka≈285.7×10-6 mol∕L。 图3中各直线在纵轴上的截距可用式（5）表示： 1/ V’max = 1/ Vmax + KA / (Vmax·[A0]) (5) 图3中各直线在纵轴上的截距对相应的Pt（Ⅳ）浓度的倒数作图也为线性，在横轴上的截距即为-（KA）-1。从图4（b）可得KA≈62.5×10-6 mol∕L。
图3 Pt（Ⅳ）活化漆酶的L-B图。 [Pt（Ⅳ）]：● 42.4，▲ 62.8，■ 85.6，○ 100.8×10-6 mol∕L。 | 图4 (a) 图3中各直线斜率对[Pt（Ⅳ）]-1图； (b). 图3中各直线在纵轴上的截距对[Pt（Ⅳ）]-1图。Vmax/Km = 0.042
2.3 可能的作用位点 图5是Pt（Ⅳ）对漆酶吸收光谱的影响。漆酶的两个特征吸收（614nm和330nm）处[3]的吸光度值均明显降低。从外观看，漆酶液从兰色变为浅绿色。用该酶液进行DDBQH2的催化氧化，发现反应速度明显上升，酶活性比原漆酶提高约25%。
图5 Pt（Ⅳ）对漆酶吸收光谱的影响。漆酶（220U/ml）：2.0ml。 [Pt（Ⅳ）]：─ 0，--- 398×10-6 mol∕L
从图5可看出，Pt（Ⅳ）对漆酶的Ⅰ型位（614nm）有一定的影响，但对Ⅲ型位（330nm）的影响更大。Pt（Ⅳ）常以配合物形式存在于络阴离子中，稳定性高，虽然它的离子半径与Cu（Ⅱ）较为接近，但由于Pt（Ⅳ）常形成八面体的空间构型，与Ⅰ型位的变形四面体构型相差较大，因此Pt（Ⅳ）并不一定会置换出漆酶Ⅰ型位中的Cu（Ⅱ），而可能是促进漆酶活性铜部位的重新调整，使其电子通道更加通畅，氧活化功能更易发挥，最终表现为激活作用。 Pt（Ⅳ）对漆酶的作用虽是浓度和时间依赖的，但浓度的影响尤为明显。当Pt（Ⅳ）浓度很小时，可能首先使漆酶的微环境发生一些变化，使其偏离原有构型，因而产生了抑制作用。但当Pt（Ⅳ）浓度超过一定范围时，可以对漆酶的活性铜部位产生影响，迅速表现为激活作用，且这种作用随时间延长而增强。 3 参考文献 [1] Nechay B R, Neldon S L. Cancer Treat Rep, 1984,68:1135 [2] Jennerwein M M, Eastman A, Khokhar A. Chem-Biol Interactions, 1989,70:39 [3] 涂楚桥，梁宏，王光辉. 高等学校化学学报,1999,20(2):243 [4] Sau A K, Mondal M S, Mitra S. J Chem Soc, Chem Commun, 1994,13:1547 涂楚桥 男，30岁，讲师，研究领域：生物无机化学和有机合成化学 ** 联系人 广西自然科学基金资助项目(桂科青9743018) 98-12-30收稿，99-05-15修回