Study on the Interaction of Serum Proteins with Calcichrome and its Application Hu Qiu-Luan#, Zhao Feng-Lin and Li Ke-An** (College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing, 100871) Abstract Calcichrome is a colouring reagent for determination of some inorganic ions. In this paper, it is found firstly that calcichrome can react with BSA to form complex in Britton-Robinson buffer at pH 4.1 and room temperature, which gives maximum absorption speak at 634 nm with 90 nm of red shift compared to that of calcichrome. The molar absorptivity of the BSA-calcichrome complex is 2.79×105 L· mol-1· cm-1 and the linear range for proteins determination is 20～160μg/ml. the standard curves were constructed under optimum conditions. The assay is sensitive, accuracy and tolerant to many foreign substances. Moreover, all the reagents are stable and the performance is easy to carry out. Keywords Serum Proteins, Calcichrome, Spectrophotometry 摘要 钙色素是测定无机离子的灵敏显色剂，研究发现该试剂能在pH 4.1的缓冲介质中，与牛血清白蛋白形成复合物，最大吸收波长为634nm，比试剂本身红移90nm，表观摩尔吸光系数为2.79×105 L·mol-1·cm-1,线性范围20～160μg/ml。实验制定的几种蛋白质的工作曲线，线性范围与牛血清白蛋白基本一致，灵敏度较高，用于人血清样品测定，结果可靠。本方法酸度范围及线性范围较宽，测定手续简便、经济。 关键词 血清蛋白质 钙色素 分光光度法 血清蛋白质与钙色素反应及分析应用的研究* 胡秋娈# 赵凤林 李克安** （北京大学化学与分子工程学院 北京 100871 #河南洛阳师范专科学校） 钙色素（C30H18N6021S6, Mr=916.42）是测定Al3+、、Co2+、Fe2+ 等无机离子的显色剂[1]，但与生物大分子的反应研究未见报道，本文首次发现钙色素与无色的牛血清白蛋白（BSA）能在酸性的Britton-Robinson [2] 缓冲介质中发生染色反应，生成红色的复合物。实验确定了钙色素与血清蛋白质反应的基本条件，研究了血清中几种蛋白质的响应情况并制定了相应的标准工作曲线，其线性范围较宽并与BSA一致，灵敏度高。研究了有可能干扰的几种物质对测定的影响，建立了以钙色素测定人血清蛋白质的分光光度法，用于人血清样品的测定，取得了可靠的结果。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 GBC 916型紫外－可见分光光度计（澳大利亚），724型可见分光光度计（上海分析仪器厂），821型pH计（中山大学）。 钙色素（上海试剂总厂，AR级）；牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、血红蛋白（Hb）、γ-球蛋白（γ-G）(美国，Sigma公司）；溶菌酶（Lyso,上海生化所）；氯化钠，无水乙醇，柠檬酸，葡萄糖，Triton X-100,CPB,SDS, Britton-Robinson系列缓冲液（简写 B-R），所用试剂均为AR级，其溶液均以二次去离子水配制。 1.2 实验方法 于10ml比色管中，依次加入2ml 5.0×10-4 mol·Ｌ-1钙色素、1.5 ml B-R缓冲溶液及一定量的BSA标准溶液，以二次水定容，摇匀。室温下以相应试剂空白作参比，用１cm比色皿于634nm处测定溶液的吸光度。 ２ 结果与讨论 2.1 吸收光谱 钙色素及其BSA复合物的吸收光谱如图１。在测定条件下，试剂的最大吸收波长为544 nm，其与BSA形成复合物的最大吸收波长为634nm，与试剂相比红移90nm，对比度较大。复合物在λmax处的吸光度与BSA的量呈线性关系，实验选择634nm作测定波长。 2.2 酸度对反应的影响 实验表明，在pH 4.0～4.7范围内，体系的吸光度无显著变化，实验中用B-R缓冲溶液1.5 ml控制溶液酸度为pH4.1。
图1 钙色素-BSA体系的吸收光谱（pH 4.1） １－钙色素的吸收曲线 ２－钙色素BSA复合物的吸收曲线 cR=7.5×10-5 mol· L-1 c (BSA)=1.47×10-6 mol· L-1
2.3 钙色素用量的影响 试剂用量在1.4～2.5 ml 范围时，体系吸光度基本不变，实验加入5.0×10-4 mol·L-1试剂2.0 ml。 2.4 温度及时间对反应的影响 试验了26℃（室温）和26℃（水浴）下时间对反应的影响，结果表明：（１）反应体系稳定，室温及35℃水浴下，反应在1 h内吸光度无显著变化。（２）反应速度较快，室温下20 min反应完成，35℃水浴中10 min反应完成。（３）温度升高，反应灵敏度增大。 2.5 离子强度的影响 用氯化钠试验了离子强度对体系的影响，如图2，c(NaCl)小于0.04 mol·L-1时，体系的吸光度无显著变化，说明该反应体系受离子强度影响不大。 2.6 乙醇的影响 实验表明：乙醇存在使反应速度和灵敏度明显提高，而且不影响反应的稳定性。如图2，当乙醇的加入量为30% (V/V)时，吸光度提高55％。乙醇对该反应体系的影响机理一般认为：随着溶剂极性和介电常数的减小，蛋白质分子中的静电斥力增大，多肽链高度伸展［３］，乙醇的介电常数远小于水，显然，随着乙醇量的增加，蛋白质分子中肽链高度伸展，使更多的活性基团暴露，利于蛋白质对染料分子的结合，因而体系吸光度增加。 2.7 表面活性剂对反应的影响 试验了不同类型的表面活性剂对反应体系的影响, 结果如图3。中性的Triton X-100存在使吸光度略有增加，其浓度为0.04% 时，Ａ提高9.5%，可能是Triton X-100使染料在水溶液中的溶解能力增强，从而提高染料与蛋白质反应的灵敏度。
图２ 氯化钠及乙醇的影响 cR=1.00×10-4 mol·L-1 c(BSA)=1.47×10-6 mol·L-1 ·Nacl ×Ethanol | 图３ 表面活性剂的影响 cR=1.00×10-4 mol·L-1 c(BSA)=1.47×10-6 mol·L-1 ▲CPB ×SDS·Triton X-100
多次实验表明：当SDS浓度≤0.025%时，体系吸光度无明显变化，随着SDS浓度的增加，吸光度明显下降，而后又上升。显然SDS参与了反应，其影响机理复杂，可能是在最初阶段SDS的脂肪族侧链与蛋白质内部区域的非极性基团相互作用［４］，因而基本不影响蛋白质与阴离子染料的作用，随着SDS浓度的增大, SDS分子中的负电荷与带正电荷的蛋白质(-NH2+)作用，减弱了蛋白质与染料分子的作用，而使反应体系的吸光度减小。随着SDS浓度的继续增加，使BSA分子以高度伸展的构象存在于溶液中，从而暴露出内部更多活性基团，使蛋白质与染料分子的结合数增加，体系的吸光度也随之增大。阳离子表面活性剂CPB使吸光度明显增大，当其浓度达0.008%时，Ａ提高40%。SDS与CPB的作用表明，钙色素与BSA在酸性条件下主要是通过静电作用形成复合物，而SDS和CPB参与了BSA (含-NH3+)与钙色素(含-SO3-)之间的静电作用。 2.8 复合物结合数的测定 用摩尔比法测定了不同浓度BSA时钙色素在BSA上的结合数，如图４、５所示，为使结合过程的变化更清晰的表现出来，用二次水作参比，并使BSA的浓度更小（见图５），多次实验表明：钙色素在BSA上的结合数约为54。 2.9 几种蛋白质的响应及其工作曲线 在确定的最佳实验条件下，制定了牛血清白蛋白的工作曲线，试验了几种有代表性而且是人血清中含量最多的蛋白质，如：人血清白蛋白（HSＡ）、血红蛋白（ Hb）、γ－球蛋白（γ-G）、溶菌酶（Lyso）的响应情况并绘制了相应的工作曲线，其回归方程、线性范围、相关系数、摩尔吸光系数（ε）及桑德尔灵敏度（Ｓ）列于表1。
表1 几种蛋白质的工作曲线
蛋白质 | 回归方程 | 线性范围 (μg/ml) | r | ε L·mol-1· cm-1 | S (μg·cm-1)
BSA HSA Hb γ-G Lyso | A =4.11×10-3C+0.025 A =2.37×10-3C+0.007 A =2.91×10-3C+0.005 A =2.04×10-3C+0.001 A =2.36×10-3C+0.017 | 20--160 20--160 20--160 20--160 20--160 | 0.9995 0.9992 0.9999 0.9999 0.9971 | 2.79×105 1.61×105 1.98×105 3.66×105 3.40×105 | 0.24 0.41 0.34 0.48 0.42
图４ 摩尔比法 c(BSA)=1.47×10-6 mol·L-1 | 图5 摩尔比法 c(BSA)=7.357×10-7 mol·L-1
2.10 干扰物质的影响 从每类氨基酸中选择１种有代表性的且是血浆蛋白中含量较高的氨基酸进行干扰性试验。实验结果表明：脯氨酸没有影响，其它几种氨基酸：亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）在高浓度时使体系吸光度略有增加（表中氨基酸的加入量40μg/ml,比人血浆中多数氨基酸的含量都高）。同时还研究了几种可能干扰的阳离子及萄萄糖、柠檬酸对体系的影响，结果表明, 这些物质对体系影响不大。由于样品测定中需将原血清样品稀释上百倍后再进行测定，所以干扰物质的影响可以不考虑。干扰物质的影响见表２。
表2 干扰物质的影响
干扰物 | Leu Ser Glu Lys Cys Tyr Pro | Pb2+ Ca2+ Fe3+ Cu2+ | 葡萄糖 | 柠檬酸
加入量 （μ g/ml） 误差（％） | 40 6.35 5.45 2.42 5.21 1.32 5.10 | 1 2.15 1.15 -0.77 0.31 | 100 4.06 | 50 -0.30
2.11 样品分析 用本方法对人血清样品的总蛋白进行测定，结果见表３，与经典的考马斯亮蓝法（CBB G-250)[5] 结果一致。方法的回收率也好，方法可靠。此法与（CBB G-250）相比，具有试剂稳定且不被器壁吸附、测定结果重现性好的优点。
表3 人血清样品总蛋白测定结果
方法 | 蛋白质 (mg/ml) | 回收率 (%) | RSD (%) (n=6)
CBB G-250 | 76.67 |  | 2.49
Calcichrome | 80.20 | 100.8 | 0.59
3 参考文献 [1] 曾云鹗等.现代化学试剂手册，第四分册. 北京：化学工业出版社，1989:296 [2] 常文保，李克安.简明分析化学手册.北京：北京大学出版社，1981:264 [3] 陶慰孙等著.蛋白质分子基础.北京：高等教育出版社，1981:243 [3] 陶慰孙等著.蛋白质分子基础.北京：高等教育出版社，1981:247 [4] Bradford ,M M . Anal.Biochem., 1976, 72:248 *国家自然科学基金资助项目 **通讯联系人 98-10-17 收稿，99-03-02 修回