Research Development of Pesticidal Bioactive Peptides Yang Guangfu，Wei Hongtao，Liu Shi (Institute of Organic Synthesis, Central China Normal University, Wuhan 430079) Abstracts Bioactive peptides displayed pesticidal activity provide a new way for the design and syntheses of novel pesticides. The research development of insecticidal, herbicidal and fungicidal bioactive peptide were reviewed and the new tools for plant chemistry protection and the prospects of pesticidal bioactive peptides were also discussed in this paper. Key words argrochemicals, bioactive peptide, structure-activity relationships 摘要 具有农药活性的生物活性肽的发现为新农药创制工作提供了新的思路。本文对具有杀虫、除草及杀菌活性的农用生物活性肽的研究进展情况进行了综述，并讨论了探索害虫化学防治的新途径以及农用生物活性肽作为农用化学品的应用前景。 关键词 农用化学品 生物活性肽 农用生物活性肽的研究进展* 杨光富 魏红涛 刘实 （华中师范大学农药化学研究所 武汉430079） 生物的种类繁多，在漫长的进化过程中，每种生物都发展了自己独特的生命体系，造成生理生化过程的差异，并由此而产生了各种不同的天然活性物质。天然活性物质的化学结构极其多样化，几乎包含了有机化合物的各种类型。从简单的分子(如乙烯)到较复杂的化合物(如除虫菊素)、直至多肽(如蜘蛛毒素NSTX-3,一种五肽)和蛋白质(如苏云金杆菌毒蛋白晶体)等大分子化合物。这些天然活性物质的生理作用是多种多样的，而且有的还具有高度的选择性和专一性。因此，从天然活性物质中寻找新颖的化学结构设计开发具有独特作用方式及良好环境相容性的新药一直是化学工作者极其感兴趣的研究课题。 近年来，在生物技术和药物化学领域，有关肽的研究取得了显著进展。活性肽或蛋白质激素具有特殊的空间构象，它们对于靶器官上的受体分子有专一的识别过程，多肽分子结构的复杂性又可能使它对不同的靶细胞具有不同的选择性。70年代以来，随着多肽分离技术和结构鉴定技术的突飞猛进，尤其是反相HPLC、二维NMR、FAB质谱和手性色谱的应用，使结构被鉴定的肽数目激增。尤其值得一提的是，近年来人们相继发现一些生物体中的某些天然活性肽具有杀虫、除草或杀菌的活性，而且有些天然活性肽还可以作为遗传工程中的植物保护剂或作为农药开发的先导化合物，这一发现无疑给在环境要求日益苛刻的条件下如何进行农药创制工作提供了新的思路。为此，本文对具有杀虫、除草和杀菌活性的肽的研究进展情况进行评述，并且对活性肽作为农用化学品的应用前景进行了展望。 1 杀虫活性肽 自1961年[1]发现在昆虫病原体真菌Metarbizium anisopliae体内产生的一组称为destruxins的化合物具有杀虫活性(如destruxin A 1、C 2和E 3 )以来，科学家在这方面进行了大量的研究工作以寻找具有更强活性的环缩肽类化合物。到目前为止[2]，已分离得到二十多个结构类似的化合物，其中许多化合物都显示了一定的生物活性。
例如，destruxins除了可以作为昆虫的神经毒素外，还表现出抑制免疫的活性，而且可以激活昆虫肌肉中的钙离子通道。destruxin E不但表现出较高的杀虫活性，而且对鼠白血病细胞具有抑制细胞生长活性和细胞毒性。目前destruxins作为植物毒素已从植物病原体真菌中分离得到。
Jaspamide[(+)-jasplakinolide][3]4是从一种海绵生物(Jaspis sp.)中分离得到的，由四个氨基酸残基组成的环状缩肽。Jaspamide对Heliothis verecens表现出一定的杀虫活性，其IC50为4×10-6, 而且对于线虫Nippostongylus braziliensis也具有毒性(LD50<1μg mL-1)。正是由于Jaspamide表现出优良的杀虫、杀菌和驱虫活性，因此人们对其全合成进行了大量的研究工作。1988年Grieco等人首次报道了Jaspamide的全合成[4]。其合成策略如Fig.1所示：
| Fig.1 Jaspamide的合成
Jaspamide环缩肽在非差向(立体)异构化位点进行大环内酯化要比在差向(立体)异构化位点进行大环内酯化优越得多。Boden-Keck条件[5](DCC/DMAP-TFA)一般都有较高的产率，而Konopelski[6]采用传统的条件(DCC)完成同样的转化，产率只有36% 。 Urashibata Ikumi[7]等在微生物中寻找昆虫生长调节剂的过程中，从链霉菌streptomyces sp.No.4403的菌体提取液中分离得到一种具有杀虫活性的环缩肽类抗菌素respirantin(I) 8,其杀虫活性几乎与抗霉素A相等，且还表现出较弱的抗菌活性。
在研究具有杀虫活性的生物活性肽中，关于昆虫神经肽的研究一直颇受人们的关注。神经肽是由神经系统合成、储存并释放的多肽类活性物质，是多细胞生物体内的重要化学信使。昆虫神经肽是以神经激素或递质形式控制着昆虫许多关键的生理过程，如生长、发育和生殖等。但由于神经肽的合成代价高昂，且不易穿透昆虫体壁，易在非靶标部位被酶降解而失活，因此一般认为神经肽本身不适合作为杀虫剂使用。因此有些学者提出，可以把昆虫神经肽行使的生理功能作为靶标，探索与现有杀虫剂作用机制完全不同的新化合物，为害虫的化学防治开辟新的途径。这一设想得到了人们的广泛重视，而且已有初步的尝试。关于这方面的详细情况可参阅有关综述[8-10]。 2 除草活性肽 具有除草作用的天然毒素多由微生物产生，如双丙氨膦(bialaphos)[11]。双丙氨膦(phosphinothricylalanyl-alanine, Ptt)是由一个不常见氨基酸phosphinothricin [L-2-氨基-4(羟基)(甲基)氧膦基丁酸，Pt]和两个丙氨酸构成的三肽，它不但具有除草活性，而且还具有一定的抗菌活性。Ptt的抗菌活性是由于其到达菌细胞后在细胞内肽酶的作用下而释放出Pt，由于Pt同谷氨酸结构的相似性，因此可以作为谷氨酰胺(GLn)合成酶的阻断剂而使谷氨酰胺的生物合成受阻，从而导致在植物体内氨的积累而使植物中毒死亡，如Fig.2所示。
| Fig.2 双丙氨磷的前体及其组装
Glyphosate 10[12](N-膦酰甲基甘氨酸，N-phosphonomethylglycine)是一个非选择性、广谱、速效的苗后除草剂，它的发现导致了许多研究机构对α-氨基膦酸衍生物的合成及生物学评价进行了广泛研究。结果发现，在这些化合物中有的具有除草活性，有的具有植物生长调节活性，而有的则具有杀菌活性。例如：Trakephon 11(二正丁基4-正丁氨基)环己基膦酸[(dibutyln-4-nbutylamino)cyclohexylphosphonate]、phosphinothricin 12、形态素的膦酸类似物13等(Fig.3)。
Fig.3 (10)Glyphosate；(11)Trakephon；(12)phosphinothricin；(13)phosphonic analogues of morphactins； (14)aminoalkylphosphonic acids；(15)peptides based on 14
但有趣的是，Wieczorek等[12]发现他们所合成的化合物14对植物的生长并没有显著的影响。经研究后发现，这些化合物植物生长调节活性缺乏的原因是其不能到达预定的作用位点。考虑到若将这些化合物与氨基酸或小肽结合后，则可以提高其穿透细胞膜或进入靶组织的能力，从而提高其活性。因此Wieczorek合成了一系列的膦酰基肽15并测定这些膦酰基肽对Lepidium sativum和Cucumis sativus生长的影响并提出了其可能的作用机制。他们认为，整个作用过程包括植物对膦酰基肽的吸收，肽键在细胞内的水解及α-氨基膦酸的释放，而释放出的这些膦酸衍生物或其代谢物可能对植物的生长有着直接影响。 植物毒素分子的结构往往很复杂，因而在很大程度上限制了它们的推广应用。为此，人们试图通过构效关系研究获得一些指导性的信息以设计合成结构简单、易于合成的活性肽的类似物。例如：Tentoxin 17是真菌Alternaria alternata产生的一个环状四肽[13]，它可以破坏豆科作物中的多种杂草及玉米田中阿拉伯高粱johnson grass体内叶绿体的形成，但对作物没有任何影响。由于Tontoxin的结构较为复杂，而且其生物合成的产率也很低，因此，人们对Tentoxin及其类似的结构与活性关系进行了深入细致的研究[14]，并探讨了其立体化学与生物活性之间的关系。例如，将天然存在的Z式异构体异构化得E式异构体后(Fig.4)，进行活性测定，结果发现天然存在的Z式异构体在10μg·mL-1的浓度下即可引起萎黄病，而E式在较高浓度时仍未观察到褪绿现象，这表明Tentoxin分子中苯环的立体取向对活性是至关重要的。此外，人们还合成了许多Tentoxin的类似物，然而遗憾的是，到目前为止还没有任何类似物的活性或专一性超过母体分子，因此关于这方面的研究工作还是十分艰巨的，仍然有大量的工作等待人们去开展。
| Fig. 4 Photoisomerization of Δz Phe tentoxin to ΔE phe tentoxin
3 杀菌活性肽 杀菌肽[15,16]是在昆虫体内诱导产生的一类具有强抗菌活性的多肽，它们具有广谱的杀菌能力。最早的抗菌多肽是由瑞典科学家Boman等从惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)中分离出来，因此后来将所有具有抗菌活性而与之有高度同源性的化合物统称为cecropin (杀菌肽)。
Fig.5杀菌肽插入脂质双层膜的模型
杀菌肽是由39多个氨基酸残基组成的小肽，等电点(PI)为8.9～9.5，100℃加热10min仍能保持一定活力，不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解。该肽链N端为含有色氨酸、赖氨酸和精氨酸的稳定区，C端为含有甘氨酸或脯氨酸残基的疏水区，中部连接部分含有脯氨酸。研究结果表明，杀菌肽N端一半可以形成一个结构近似完美的极化的两亲性(amphipathic)α-螺旋，即圆柱形分子的纵轴一边是带正电荷的亲水基团而对称面是疏水区，C端一半为一疏水尾。杀菌肽的抗菌活性正是依赖于其两亲性的α-螺旋结构。在昆虫体内杀菌肽的生理浓度下，这种结构使之可以在原核细胞质膜上形成巨大的时间性及电压依赖性的离子通道。从H.cecropia中分离出的杀菌肽A、B和D均可以形成这种通道，而融合杀菌肽AD(包括杀菌肽A的1～11个氨基酸及杀菌肽D的12～37个氨基酸残基)则更能有效地形成通道，其抗菌活性也十分强大。因此，杀菌肽抗菌的关键是在质膜上形成离子通道性质的孔洞，致使细胞内外渗透压改变，细胞内容物尤其是K+大量渗出，细菌因此而死亡。 杀菌肽插入细菌质膜的过程可能如下：第一步，在水相与质膜交界面上，杀菌肽寡聚物与脂质双层膜之间通过静电吸引而靠近，带正电荷的肽端集聚于此；第二步：C端疏水区插入膜中，两亲性的α-螺旋滞留于界面的位置。此步骤的关键不在于α-螺旋结构本身，而取决于N端α-螺旋与强疏水C端之间的连接结构。柔性伸展的连接易于完成此过程，若为刚性连接，则不能完成。第三步：两亲性的α-螺旋插入质膜，由于其亲水，疏水两性存在，在质膜上形成较大孔洞，细胞因而不能保持正常渗透压而致死。 当然，关于这方面的研究还有待进一步深入。我们可以相信，随着对杀菌肽作用机理的进一步了解，人们将可能设计出用于农业或医药工业的更为有效的杀菌肽。例如，在寻找具有杀菌能力的肽类化合物中，也成功地找到一些具有抗微生物活性的小肽，如一种肠道细菌(Enterobacter)发酵得到N-酰化二肽衍生物18[17]，其抗X.Campestris oryzae最小阻断浓度为0.1μg·mL-1。18因具有低毒，稳定和专一性等特点而被发展成为农用杀菌剂[18]。
4 结束语 综上所述，生物活性肽作为农用化学品的研究已取得了一定的进展，并已初步展现出十分诱人的广阔前景。然而，由于生物活性肽的结构往往较为复杂，其分子中一般具有多个不对称中心，生物活性表现出很强的立体专一性。此外，由于农药的保护对象是群体(作物)，而医药的保护对象却是个体(人)，而且目前人们对活性肽的生化作用机制还不是十分清楚，因此，生物活性肽作为农用化学品而真正加以推广应用还有很长的一段路要走。尽管如此，我们仍然可以相信，随着生物活性肽生化作用机制的不断阐明、活性肽类似物构效关系研究的逐步深入以及有机合成技术特别是不对称合成技术的飞速发展，设计合成活性更高、结构更为简单的生物活性肽类似物在不远的将来一定会成为现实，而利用生物技术将生物活性肽直接作为农药加以使用也具有十分广阔的应用前景。 5 参考文献 [1] Kodaira Y, Agric.Biol.Chem.1961,25: 261 [2] Wahlman M, Davidson B, New destruxins from the entomopathogenic fungus Metarbizium anisopliae . J. Nat. Prod., 1993, 56(4): 643-647 [3] Crews P, Manes L V, Boehler M, et al, Jasplakinolide, a cyclodepsipeptide from the marine sponge Jaspis sp.. Tetrahedron Lett., 1986, 27(25): 2797-2800 [4] Grico P A, Hon Y S, Medrano A P, A convergent, enantiospecific total synthesis of the novel cyclodepsipeptide (+)-jasplakinolide ( Jaspamide ). J. Am. Chem. Soc., 1988, 110: 1630-1631 [5] Boden E P, Keck G E, Proton-Transfer steps in steglich esterification: a very practical new method for macrolactonization. J. Org. Chem., 1985, 50: 2394-2395 [6] Chu K S, Wegrete G R, Konopelski J P, Asymmetric total synthesis of (+)-jasplakinolide. J. Org. Chem., 1991, 56: 5196-5202 [7] Ikumi U, Akira I, Shogo M, et al, respirantin, a novel insecticidal cyclodepsipeptide from streptomyces. J. Antibiot., 1993, 46(4): 701-703 [8] Evans P D, Robb S, Cuthbert B A, Insect neuropeptides: Identification, estabishment of functional roles and novel target sites for pesticides. Pestic. Sci., 1989, 25: 71-83 [9] 徐建华，尚稚珍，昆虫神经肽的研究进展，昆虫知识，1995，32(5)：307-310 [10] Menn J J, Borkovec A B, Insect neuropeptides: potential new insect control agents, J. Agric. Food. Chem., 1989, 37: 271-278 [11] Dohren H V, keller U, Vater J, et al, Multifunctional peptide synthetases, Chem. Rev., 1997, 97(7): 2675-2705 [12] Wieczorek P, Lejczak B, Kaczanowska M, et al, Plant-growth-regulating phosphono peptides, Pestic. Sci., 1990, 30: 43-57 [13] Edwards J V, Dailey A D, Bland J M, et al, ACS Symposium Series, 1988, 380: 35 [14] Bland J M, Edwards V, Eaton S R, et al, Natural peptidic compounds as leads for novel pesticides, Pestic. Sci., 1993, 39: 331-340 [15] 张然，陈濂生，张宗炳，蜚蠊灭菌肽的诱导及初步分离分析，昆虫学报，1990，33(1)：7-12 [16] 崔晓江，刘枝俏，田颖川等，杀菌肽的研究进展及应用前景，生物化学与生物物理进展，1995，22(1)：5-8 [17] Fureedenheagen A, Myoji S, Koji N, JP 63,132,873 [18] Hiroshi K, Matsukuootaa U D, JP 01,301,657 杨光富 男，28岁，博士，副教授，现从事农药分子设计、合成及构效关系研究。 国家自然科学青年基金(29802002)和湖北省自然科学基金资助。98-12-25收稿